الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكيّة القولونية بالإعراب شارك الجيش الملكي النيبالي تشيميريك التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة فرويد ومصنع للحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. المنتج الرئيسي هو جزيء تعميم الذي يسهل تنقية للتجانس.
Abstract
ومع تزايد الاهتمام بالبيولوجيا الجيش الملكي النيبالي، واستخدام جزيئات الحمض النووي الريبي في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية تطورا، الأساليب التي تنتج كميات كبيرة من الكشف المؤتلف محدودة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكيّة القولونية يستند التعبير المشارك من جزيء تشيميريك التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة فرويد ومصنع للحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. فيرويدس يتم الكشف دائرية صغيرة نسبيا، غير الترميز، درجة عالية من إقران قاعدة يتم المعدية على النباتات العليا. النباتات المضيفة الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى هو إنزيم جندهم فيرويدس التي تنتمي إلى الأسرة، أفسونفيرويدايمثل فرويد الكامنة الباذنجان (الفد)، للتوسط على الجيش الملكي النيبالي أثناء النسخ المتماثل فرويد. على الرغم من أن الفد لا النسخ المتماثل في كولايوكفاءة يتم نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي كولاي مؤشرا الفد ويتم معالجتها بواسطة ribozymes المطرقة المضمنة في الخلايا البكتيرية، وهي سيركولاريزيد مونومرات الناجمة عن ذلك شارك أعرب ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال التوصل إلى تركيز ملحوظ. إدراج الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة الفد يتيح إنتاج عشرات ملليغرام من المؤتلف الحمض النووي الريبي للتر الواحد من ثقافة البكتيرية في الظروف المختبرية العادية. جزء الرئيسي من المنتج الجيش الملكي النيبالي التعميم، ميزة تسهل على تطهير الجيش الملكي النيبالي المؤتلف إلى التجانس الظاهري. في هذا البروتوكول، يتم إدراج المقابلة الحمض النووي (كدنا) مكملة للجيش الملكي النيبالي للفائدة في موضع معين من كدنا الفد في تعبير بلازميد المستخدمة، على طول بلازميد لﻹعراب الباذنجان الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى، شاركت في تحويل كولاي. التعبير المشترك كلا الجزيئات تحت سيطرة المروجين التأسيسي قوي يؤدي إلى إنتاج كميات كبيرة من الجيش الملكي النيبالي المؤتلف. يمكن استخراجه من الخلايا البكتيرية الجيش الملكي النيبالي المؤتلف وفصلها عن الجزء الأكبر الكشف البكتيرية الاستفادة به دائرية.
Introduction
وعلى النقيض من الحمض النووي والبروتينات، بروتوكولات لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي سهلة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة ليست وفيرة. ومع ذلك، متطورة الطلب البحوث والصناعة زيادة مبالغ هذه الجزيئات الحيوية للتحقيق عن الخصائص البيولوجية الفريدة1، أو استخدامها في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية، بما في ذلك استخدامها الابتامرات محددة للغاية 2أو3من العوامل العلاجية أو مبيدات انتقائية4. النسخ في المختبر والتوليف الكيميائية تستخدم عادة في البحوث لإنتاج الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، هذه الأساليب تستتبع القيود الهامة عندما يتطلب الأمر كميات كبيرة من المنتجات. البديل المنطقي لاستخدام آلات النسخ الذاتية من الخلايا الحية، تليها عملية تنقية لفصل الكشف لمصلحة من رفاقه الخلوية. وفي أعقاب هذه الاستراتيجية، وضعت أساليب لإنتاج الكشف المؤتلف في الخلايا البكتيرية، مثل المختبر الصديقة الإشريكيّة القولونية5 أو البحرية الأرجواني فوتوتروفيك ألفا-بروتيوباكتيريوم سولفيدوفيلوم رهودوفولوم 6-معظم الأساليب لإنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف في البكتيريا تعتمد على التعبير عن السقالة الحمض النووي الريبي مستقرة جداً الأصلي، مثل إدراج7الحمض الريبي النووي النقال أو الرنا الريباسي، التي يكون فيها الجيش الملكي النيبالي للفائدة. وهذا يفرض ضرورة الإفراج عن الجيش الملكي النيبالي للفائدة من جزيء تشيميريك، في حالة وجود الحمض النووي الريبي إضافي مشكلة بالنسبة للتطبيقات المصب8. مفهوم آخر في المؤتلف الحمض النووي الريبي التكنولوجيا الأحيائية هو إنتاج مجمعات ribonucleoprotein التوليفية التي قد تكون المنتج المطلوب في حد ذاتها أو تستخدم كاستراتيجية وقائية لزيادة الاستقرار في الجيش الملكي النيبالي للفائدة9، 10. وبالمثل، اقترحت أيضا كاستراتيجية لتوليد منتجات أكثر استقرارا11إنتاج الكشف دائرية.
قمنا مؤخرا بتطوير أسلوب جديد لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في كولاي التي تشارك في ثلاثة من المفاهيم المذكورة أعلاه: الإدراج من الجيش الملكي النيبالي للفائدة في سقالة الحمض النووي الريبي دائرية عالية مستقرة والتعبير المشترك عن رنا المؤتلف مع بروتين التفاعل المحتمل أن إنتاج ribonucleoprotein مستقرة معقدة التي تتراكم في المبالغ الملحوظة في البكتيريا خلايا12. على النقيض من التطورات السابقة، استخدمنا الحمض النووي الريبي سقالة غريبة تماما على كولاي، إلا وهي فرويد. فيرويدس هي نوع خاص جداً من العوامل المعدية من النباتات العليا التي تتألف حصرا من صغيرة نسبيا (nt 246-401) درجة عالية من إقران قاعدة التعميم الحمض النووي الريبي13. من المثير للاهتمام، فيرويدس هي غير الترميز الكشف، ومع أي مساعدة من البروتينات الخاصة بها، فقادرة على إكمال دورات المعدية المعقدة في المضيفين المصابة14. تشمل هذه الدورات تكرار الحمض النووي الريبي للجيش الملكي النيبالي في نوى أو المعايشة، اعتماداً على الأسرة فيرويد –بوسبيفيرويداي أو أفسونفيرويداي، على التوالي – الحركة عن طريق النباتات المصابة والتهرب من استجابة دفاعية المضيف. يجب أن يتم تصنيفهم فيرويدس بين الكشف الأكثر استقرارا في طبيعتها، ونتيجة ليجري الحمض النووي الريبي دائرية عارية، والحاجة إلى البقاء على قيد الحياة في بيئة معادية للخلايا النباتية المصابة. وقد جعل هذه الخاصية فيرويدس مناسبة خاصة السقالات على استقرار المؤتلف الحمض النووي الريبي في نهج التكنولوجيا الحيوية. وباﻹضافة إلى ذلك، أسلوب جديد يستند إلى التعبير المشارك من السقالة فرويد مع بروتين النباتي متفاعلة. فيرويدس نسخاً متماثلاً من خلال إليه دائرة المتداول في استضافة التي يجند الإنزيمات لتحفيز الخطوات المختلفة لهذه العملية. لا سيما بعض فيرويدس، وبشكل أكثر تحديداً تلك التي تنتمي إلى أفسونفيرويدايالأسرة15، تحتوي على ريبوزيميس التي تشارك أيضا في عملية النسخ المتماثل. تبعاً للأنواع الأحيائية فرويد، توسط نسخ فرويد الكشف المضيفة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني أو بوليميريز الحمض النووي الريبي النووي ترميز تشلوروبلاستيك (NEP). معالجة فرويد الجيش الملكي النيبالي ويبدو أن تحفزها مضيف رناسي نوع-ثالثا، على الرغم من أن تنشق وسيطة في فيرويدس مع الحمض النووي الريبي أوليجوميريك ribozymes ذاتيا أثناء النسخ المتماثل. وأخيراً، مونومرات فرويد الناتجة هي سيركولاريزيد، اعتماداً على الأسرة، وفرويد ليجاسى الحمض النووي المضيف 1 أو isoform تشلوروبلاستيك الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى16،17. هذا الإنزيم الأخير تشارك في عملية ربط أحادي أشكال فيرويدس في الأسرة أفسونفيرويداي، مثل فرويد الكامنة الباذنجان (الفد)18.
أثناء عمل تحليل متطلبات الفد تسلسل والهيكلية التي تحدد الاعتراف بالباذنجان (Solanum melongena L.) ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال، أنشأنا نظام تجريبي يستند إلى التعبير المشترك لكل الجزيئات في كولاي 19-لاحظنا أن تنشق ذاتية أطول من وحدة الفد النصوص كفاءة في الخلايا كولاي عن طريق ribozymes المطرقة جزءا لا يتجزأ، وأن مونومرات فرويد الناتجة مع 5 ‘-هيدروكسيل و 2’، 3 ‘-phosphodiester تيرميني كانت كفاءة سيركولاريزيد من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان أعرب المشترك. بل أكثر من ذلك، رنا فرويد التعميم الناتج الذي تم التوصل إليه بتركيز عال غير متوقعة في كولاي، تتجاوز تلك التي ررناس الذاتية12. أظهرت عدم وجود وسيطة النسخ المتماثل عدم التضخيم الفد الحمض النووي الريبي للجيش النيبالي الملكي في هذه الخلايا البكتيرية. من المثير للاهتمام، الإدراج للكشف مغايرة في موقف معين للجزيء فرويد أثرا معتدلة في تراكم الكشف مشتقة فرويد-التعميم12. هذه الملاحظات جعلتنا نتصور طريقة لإنتاج كميات كبيرة من المؤتلف الكشف في البكتيريا. في هذا الأسلوب، يتم إدراج كدناس المقابلة للكشف الفائدة في كدنا الفد والجيش الملكي النيبالي تشيميريك الناتجة في كولاي عن طريق أحد المروجين تأسيسي قوية. لنظام العمل، يجب تحويل كولاي يشترك مع بلازميد للتعبير عن ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان. نسخة أطول من الوحدة المشتقة من الفد تتم معالجتها بواسطة ribozymes المطرقة جزءا لا يتجزأ ومعترف بها وسيركولاريزيد من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال المشترك أعرب مونومرات الناتجة مع تيرميني المناسبة. بهذه الطريقة، يتم إدراج الجيش الملكي النيبالي لمصلحة سقالة دائرية مستقرة جداً يتألف من جزيء دائري فرويد. هذا الحمض النووي الريبي تشيميريك المؤتلف على الأرجح كذلك استقرت داخل الخلايا كولاي بتشكيل ribonucleoprotein المعقدة من خلال التفاعل مع الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. باستخدام هذا الأسلوب (انظر البروتوكول أدناه)، الابتامرات الجيش الملكي النيبالي ودبوس الكشف وغيرها الكشف المنظم بسهولة أنتجت بكميات عشرات مليغرام للتر الواحد من الثقافة كولاي في الظروف المختبرية العادية وتنقيته للتجانس مع أخذ الاستفادة من تدوير12.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء البحث في تسلسل الفد ومتطلبات بنية المشاركة في الاعتراف بواسطة ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان، لاحظنا أن التعبير المشترك كل الجزيئات في غير المضيفة كولاي التي أدت إلى تراكم فرويد دائرية كبيرة غير متوقعة أشكال في الخلايا البكتيرية19. أننا فهمنا أن تراك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل منح BIO2017-83184 آر واكسب-BIO2017-91865 من وزارة العلوم دي الإسبانية, Innovación y جامعات (FEDER صناديق التمويل المشترك).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
- Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
- Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
- Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
- Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
- Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
- Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
- Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
- El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
- Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
- Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
- Daròs, J. -. A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
- Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).
- Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
- Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
- Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
- Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
- Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
- Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
- Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
- Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
- Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
- López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).
