대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

Summary

여기, 선물이 공동 표현 공상 RNA 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하 여 많은 양의 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜 tRNA 리가. 주요 제품은 동질성을 정화를 용이 하 게 원형 분자 이다.

Abstract

RNA 생물학과 정교한 바이오 응용 프로그램에서 RNA 분자의 사용에 대 한 관심 증가, 재조합 RNAs의 다량을 생성 하는 방법을 제한 됩니다. 우리가 많은 양의 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하는 공상 분자의 공동 식에 따라 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, tRNA 리가. Viroids는 상대적으로 작은, 비 코딩, 높은 베이스 결합 원형 RNAs 더 높은 식물에 전염성이 있다. 호스트 공장 tRNA 리가 중재 바이로이드 복제 동안 RNA circularization Avsunviroidae, 가지 잠재 바이로이드 (ELVd), 같은 가족에 속하는 viroids에 의해 보충 하는 효소 이다. 비록 ELVd 대장균에 복제 하지 않습니다, ELVd 전조 대장균 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 효율적 이며 임베디드 귀상어 ribozymes 세균성 세포에 의해 처리 결과 단위체에 의해 circularized는 공동 표현된 tRNA 리가 놀라운 농도 도달입니다. ELVd 비 계에의 한 RNA의 삽입 당 세균성 문화 일반 실험실 조건에서의 재조합 RNA의 밀리 그램 수만의 생산 수 있습니다. RNA 제품의 주요 일부분 이다 원형, 가상 동질성을 재조합 RNA의 정화를 용이 하 게 하는 기능. 이 프로토콜에는 보완 DNA (cDNA)에 해당 하는 관심의 RNA는 사용 되는, 공동 가지 tRNA 리가 표현 하는 플라스 미드 따라 대장균을 변환 하는 식 플라스 미드에 ELVd cDNA의 특정 위치에 삽입 됩니다. 강력한 제정 발기인의 통제 아래 두 분자의 공동 식 대량의 재조합 RNA의 생산 리드. 재조합 RNA 세균 세포에서 추출 하 고 세균성 RNAs의 순환 활용의 대부분에서 분리 수 있습니다.

Introduction

DNA와 단백질, 대조적으로 많은 양의 RNA의 쉽게, 효율적이 고 비용 효율적인 생산을 위한 프로토콜 풍부 하지 않습니다. 그러나, 연구 및 산업 수요 또는 그들의 독특한 생물 속성¹, 조사에 사용할 이러한 생체의 금액을 증가 정교한 매우 구체적인 aptamers로 그들의 사용을 포함 한 바이오 응용 프로그램 ², 치료제³또는 선택적인 농약⁴. 생체 외에서 전사 및 화학 합성 일반적으로 사용 됩니다 연구에서 RNA를 생산. 그러나, 이러한 방법은 제품의 대용량이 필요한 경우 중요 한 한계를 수반. 논리적 대안 살아있는 세포, 세포 동료 로부터 관심의 RNAs를 분리 하는 정화 과정 뒤의 내 인 성 전사 기계를 사용 하는 것입니다. 이 전략에 따라 방법은 실험실-친화 등의 세균성 세포에서 재조합 RNAs를 생산 하기 위해 개발 되었다 대장균⁵ 나는 해양 보라색 광합성 알파-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum ⁶. 세균에 재조합 RNA를 생성 하는 대부분의 메서드와 tRNA 또는 관심의 RNA가는 rRNA 삽입⁷같은 네이티브 매우 안정적인 RNA 발판의 표현에 의존. 이 여분의 RNA의 존재는⁸다운스트림 응용 프로그램 대 한 문제 경우 공상 분자에서 관심의 RNA를 공개의 필요성을 부과 한다. 재조합 RNA 생명 공학의 또 다른 개념은 재조합 ribonucleoprotein 단지는 원하는 제품 당 있을 수 있습니다 또는 보호 전략으로 관심^{9, RNA의 안정성을 증가 하는 데 사용의 생산 10}. 마찬가지로, 원형 RNAs의 생산 또한 더 안정적인 제품¹¹을 생성 하는 전략으로 제안 되었습니다.

우리는 최근 많은 양의 3 위의 개념에 참여 하는 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 새로운 방법을 개발: 매우 안정적인 원형 RNA 비 계에 대 한 관심의 RNA와의 공동 식의 삽입은 박테리아의 놀라운 금액에 축적 가능성이 복잡 한 안정 되어 있는 ribonucleoprotein를 생산 하는 상호 작용 단백질으로 재조합 RNA 세포¹². 이전 개발, 달리 완전히 외계인 대장균, 즉 바이로이드 RNA 발판을 사용 했습니다. Viroids는 매우 특별 한 종류 (246-401 nt) 상대적으로 작은 의해 독점적으로 구성 되는 더 높은 식물의 전염 성 요원의 높은 베이스 결합 원형 RNA¹³. 흥미롭게도, viroids는 비 코딩 RNAs 그리고, 그들의 자신의 단백질에서 도움 없이, 그들은 감염 된 호스트¹⁴에서 복잡 한 감염 주기를 완료 수 있습니다. 이러한 사이클 핵 또는 엽록체, 바이로이드 가족에 따라 RNA RNA 복제 포함-Pospiviroidae 또는 Avsunviroidae각각-감염 된 식물 및 호스트 방어 반응의 회피를 통해 이동. Viroids는 자연, 누드 원형 RNA 되 고 감염 된 식물 세포의 적대 하는 환경에서 생존 하는 것 때문에 가장 안정적인 RNAs 중 평가 해야 합니다. 이 속성 viroids 건설 기계 바이오 접근에 재조합 RNA 안정화에 특히 적합 한 만들 수 있습니다. 또한, 새로운 메서드는 상호 작용 식물 단백질 바이로이드 발판의 공동 식 기반으로 합니다. Viroids는 호스트에 효소 촉매 과정의 다른 단계를 모집 롤링 원 메커니즘을 통해 복제 합니다. 특히 일부 viroids, 좀 더 구체적으로 그 가족 Avsunviroidae¹⁵에 속하는 ribozymes 또한 복제에 관련 된 포함 되어 있습니다. 바이로이드 종에 따라 바이로이드 RNAs의 전사는 RNA 중 합 효소 II 호스트나는 chloroplastic 인코딩 핵 RNA 중 합 효소 (NEP)에 의해 중재 됩니다. 바이로이드 RNA 처리 호스트에 의해 촉매 될 것 유형 III RNase, 비록 ribozymes oligomeric RNA와 viroids에서 중간체는 자기 복제 하는 동안 다니엘. 마지막으로, 결과 바이로이드 단위체는 circularized, 바이로이드 가족에 따라 호스트 DNA 리가 1 또는 tRNA 리가^16,17의 chloroplastic isoform에 의해. 이 마지막 효소 가지 잠재 바이로이드 (ELVd)¹⁸등 가족 Avsunviroidae, viroids의 단위체 형태의 결 찰에 포함 된다.

가지 (지속의 총칭 melongena L.)에 의해 인정을 결정 하는 ELVd의 순서 및 구조 요구를 분석 하는 작업 과정에서 tRNA 리가 우리 대장균 에 두 분자의 공동 식에 따라 실험 시스템 설정 ¹⁹. 우리 것으로 나타났습니다 그 단위 보다 더 긴 ELVd 증명서 자체 쪼개 효율적으로 임베디드 귀상어 ribozymes 통해 대장균 세포에 결과 바이로이드 단위체와 5′-수 산 기 2′, 3′-phosphodiester 테르미니 했다 효율적으로 공동 표현된 가지 tRNA 리가 여 circularized. 더욱, 결과 원형 바이로이드의 RNA 생 rRNAs¹²의 초과 대장균에서 예기치 않은 높은 농도 도달. 복제 중간체의 부재가 세균 세포에서 ELVd RNA RNA 증폭의 부족을 표시. 흥미롭게도, 바이로이드 분자의 특정 위치에 분리 RNAs의 삽입 원형 바이로이드 파생 RNAs¹²의 축적에 온건한 영향을 미쳤다. 이러한 관측 우리가 많은 양의 재조합 박테리아에 RNAs 생산 하는 방법을 구상 했다. 이 방법에서는, cDNAs의 RNAs에 해당 ELVd cDNA에 삽입 하 고 결과 공상 RNA 강한 제정 발기인 통해 대장균 에서 표현 된다. 시스템 작동에 대 한 대장균 공동 가지 tRNA 리가 표현 하는 플라스 미드와 변형 될 해야 합니다. ELVd에서 파생 된 단위 보다 더 이상 사본 포함된 귀상어 ribozymes에 의해 처리 되 고 적절 한 테르미니와 결과 단위체는 인식 하 고 공동 표현된 tRNA 리가 여 circularized. 이러한 방법으로, 관심의 RNA 바이로이드 원형 분자의 구성 된 매우 안정적인 원형 발판에 삽입 됩니다. 이 재조합 공상 RNA는 대부분의 아마 더 tRNA 리가와 상호 작용을 통해 복잡 한 ribonucleoprotein의 형성에 의해 대장균 세포 안으로 안정. 이 메서드를 사용 하 여 (프로토콜 아래 참조), RNA aptamers, 헤어핀 RNAs 및 다른 구조화 된 RNAs 쉽게 일반 실험실 조건에서 대장균 문화의 리터 당 밀리 그램의 10의 금액에서 생산 되었고 복용 동질성을 정화 원형¹²의 장점입니다.

Protocol

1. 플라스 미드 건설 PCR에 의해 (또는) 반전 녹음 방송 RNA 서식 파일에서 시작 하는 경우에, PCR에 의해 증폭 식 플라스 미드에 있도록 5′ 확장명이 뇌관을 사용 하 여 관심사의 RNA에 해당 하는 cDNA. 고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 원치 않는 변이 방지. 깁슨 어셈블리20식 플라스 미드에는 cDNA를 삽입 하려면 다음 5′ 확장 PCR 뇌관을 추가: 앞으로, 5′-t…

Representative Results

ELVd 파생 시스템12을 사용 하 여 대장균 에서 재조합 RNA를 생성 하려면 관심의 RNA는 ELVd RNA 비 계에 투입 이다. 이 공상 RNA 가지 tRNA 리가 대장균에 따라 공동 표현 이다. 일단 처리 하 고 죽 습 circularized에서 관심의 RNA 돌출, 공상 원형 RNA 가능성이 세균 세포 ( 에 있는 현저한 농도 도달 공동 표현된 가지 효소와 복잡 한 ribonucleop…

Discussion

ELVd 시퀀스 및 구조 요구 사항 가지 tRNA 리가 여 인식에 관련 된 연구를 하는 동안 우리 주의 원형 바이로이드의 예기치 않은 큰 축적에 비 호스트 대장균 에 두 분자의 공동 식 세균성 세포¹⁹에 양식입니다. 우리가 이해 하는 대장균 에 RNA 바이로이드의 큰 축적 아마 공동 표현 등 상대적으로 작은 매우 안정적인 RNA 분자의 결과 이었다 (333 nt), 높은 기반-결합, 원형 바…

Materials

Phusion High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acetic acid	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidium bromide	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Tryptone	Intron Biotechnology	Ba2014
Yeast extract	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Boric acid	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G