Production à grande échelle d’ARN Recombinant sur un échafaudage circulaire utilisant un système dérivé de Viroid chez Escherichia coli
Summary
Nous présentons ici un protocole pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans Escherichia coli en exprimant conjointement un ARN chimérique qui contient de l’ARN d’intérêt à un échafaudage viroïde et une usine ligase d’ARNt. Le produit principal est une molécule circulaire qui facilite la purification jusqu’à homogénéité.
Abstract
Avec un intérêt croissant dans biologie des ARN et de l’utilisation de molécules d’ARN dans des applications biotechnologiques sophistiquées, les méthodes pour produire de grandes quantités d’ARN recombinant sont limités. Nous décrivons ici un protocole pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans Escherichia coli , basé sur la co-expression de molécule chimérique qui contient de l’ARN d’intérêt dans un échafaudage viroïde et une usine de ligase d’ARNt. Viroïdes sont relativement petites, non codante, fortement couplé base ARN circulaire qui est infectieux aux plantes supérieures. L’hôte plante tRNA ligase est une enzyme recrutée par les viroïdes qui appartiennent à la famille Avsunviroidae, tels que l’ aubergine viroid latent (ELVd), comme médiateur circularization RNA lors de la réplication viroïde. Bien que ELVd ne se répliquent pas dans e. coli, un précurseur ELVd est efficacement transcrits par l’ARN polymérase d’e. coli et traité par les ribozymes hammerhead embarqués dans des cellules bactériennes et les monomères résultants sont prospectés par la ligase d’ARNt exprimée conjointement pour atteindre une concentration remarquable. L’insertion d’un ARN d’intérêt dans l’échafaudage ELVd permet la production de dizaines de milligrammes de recombinant RNA par litre de culture bactérienne dans des conditions de laboratoire réguliers. Une fraction principale du produit RNA est circulaire, une fonctionnalité qui facilite la purification de l’ARN recombiné à l’homogénéité de virtuelle. Dans le présent protocole, un ADN (cDNA) complémentaire correspondant à l’ARN d’intérêt est inséré dans une position particulière du cDNA ELVd dans un plasmide d’expression qui est utilisé, le long du plasmide d’exprimer conjointement aubergine ligase d’ARNt, pour transformer les e. coli. La co-expression de ces deux molécules sous le contrôle des promoteurs constitutifs fortes mène à la production de grandes quantités de l’ARN recombiné. L’ARN recombiné peut être extrait des cellules bactériennes et séparé de la majeure partie des ARN bactérien en profitant de sa circularité.
Introduction
Contrairement à l’ADN et les protéines, les protocoles pour simple, efficace et rentable de production de grandes quantités d’ARN ne sont pas abondantes. Cependant, recherche et industrie demande augmentant les montants de ces biomolécules pour étudier leurs propriétés biologiques uniques1ou devant être utilisés dans sophistiquée des applications biotechnologiques, y compris leur utilisation comme aptamères hautement spécifiques 2, agents thérapeutiques3ou pesticides sélectifs4. Transcription in vitro et synthèse chimique sont couramment utilisés en recherche pour produire des RNA. Cependant, ces méthodes entraînent des limitations importantes lorsque de grandes quantités de produits sont nécessaires. L’alternative logique consiste à utiliser la machinerie de transcription endogène des cellules vivantes, suivie d’un processus de purification pour séparer les compagnons cellulaires de l’ARN d’intérêt. Suite à cette stratégie, des méthodes ont été développées pour produire des ARN recombinants dans des cellules bactériennes, telles que le laboratoire de l’environnement Escherichia coli5 ou la marine violet phototrophe alpha-protéobactérie Rhodovolum sulfidophilum 6. la plupart des méthodes pour produire des ARN recombiné dans les bactéries s’appuient sur l’expression d’un échafaudage de RNA extrêmement stable indigène, tels qu’un ARNt ou un ARNr, dans lequel l’ARN d’intérêt est inséré7. Cela impose la nécessité de libérer l’ARN d’intérêt hors de la molécule chimérique, si la présence d’ARN supplémentaire est un problème pour les applications en aval à8. Un autre concept en recombinant biotechnologie RNA est la production des complexes ribonucléoprotéiques recombinant qui peut être le produit désiré en soi ou utilisés comme une stratégie de protection pour augmenter la stabilité de l’ARN d’intérêt9, 10. De même, la production d’ARN circulaire a également été suggérée comme une stratégie visant à générer la plus stable de produits11.
Nous avons récemment développé une nouvelle méthode pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans e. coli qui participe à trois des concepts ci-dessus : l’insertion de l’ARN d’intérêt dans un échafaudage de RNA circulaire très stable et la co-expression de la ARN recombiné avec une protéine d’interaction pour produire probablement un complexe ribonucléoprotéique stable qui s’accumule en quantités remarquables dans bacterial cells12. Par contraste avec les développements précédents, nous avons utilisé un échafaudage de RNA totalement étranger à e. coli, à savoir un viroïde. Viroïdes sont un type très particulier d’agents infectieux des plantes supérieures qui sont exclusivement constitués par une relativement petite (nt 246-401) fortement couplé base circulaire RNA13. Fait intéressant, les viroïdes sont non-coding RNAs et, sans aide de leurs propres protéines, ils sont capables de remplir des cycles complexes infectieuses dans les hôtes infectés14. Ces cycles incluent la réplication de l’ARN-à-ARN dans les noyaux ou les chloroplastes, selon la famille du viroïde —Pospiviroidae ou Avsunviroidae, respectivement — mouvement à travers la plante infectée et l’évasion de la réponse défensive de l’hôte. Viroïdes doivent être classés parmi les ARN plus stables dans la nature, par suite d’avoir un ARN circulaire nue et devoir survivre dans l’environnement hostile des cellules végétales infectés. Cette propriété peut rendre les viroïdes particulièrement adapté comme les échafaudages pour stabiliser recombinant RNA dans les approches biotechnologiques. En outre, la nouvelle méthode s’inspire de la co-expression de l’échafaud viroïde avec une interaction protéine végétale. Viroïdes se répliquent via un mécanisme de cercle roulant dans quel hôte enzymes sont recrutés pour catalyser les différentes étapes du processus. Notamment certains viroïdes, plus particulièrement ceux qui appartiennent à la famille Avsunviroidae15contiennent des ribozymes également impliqués dans la réplication. Selon l’espèce viroïde, transcription du viroïde RNAs est médiée par l’hôte de l’ARN polymérase II ou le chloroplaste codées ARN polymérase (NEP). Traitement du viroïde RNA semble être catalysée par un hôte type III RNase, bien que dans les viroïdes ribozymes ARN oligomériques intermédiaires cleave automatique lors de la réplication. Enfin, les monomères viroïde qui en résultent sont prospectés, selon la famille du viroïde, par la hôte DNA ligase 1 ou l’isoforme chloroplastique de tRNA ligase16,17. Cette dernière enzyme est impliquée dans la ligature des formes monomères des viroïdes appartenant à la famille Avsunviroidae, tels que l’ aubergine viroid latent (ELVd)18.
Dans le cadre d’un travail d’analyser les exigences structurelles et séquence de ELVd qui déterminent la reconnaissance de l’aubergine (Solanum melongena L.) ligase d’ARNt, nous avons mis en place un système expérimental basé sur la co-expression de ces deux molécules chez e. coli 19. nous avons remarqué que transcriptions ELVd plus-que-unit cleave automatique efficacement dans les cellules d’Escherichia coli par les ribozymes hammerhead incorporé et que les résultante monomères viroïde avec 5′-hydroxyle et 2′, 3′-phosphodiester termini était prospectés efficacement par la ligase d’ARNt aubergine conjointement exprimé. Plus encore, l’ARN viroïde circulaire qui en résulte atteint une concentration élevée inattendue chez e. coli, supérieures à celles de l’ endogène rRNA12. Absence d’intermédiaires de réplication a indiqué manque d’amplification ELVd ARN-à-ARN dans ces cellules bactériennes. Fait intéressant, insertion de RNAs hétérologues dans une position particulière de la molécule du viroïde avait un effet modéré sur l’accumulation de l’ ARN circulaire viroïde dérivés12. Ces observations nous a fait imaginer une méthode pour produire de grandes quantités de recombinaison ARN chez les bactéries. Dans cette méthode, l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt sont insérés dans le cDNA ELVd et l’ARN chimérique qui en résulte est exprimée chez e. coli par un promoteur constitutif fort. Pour le système fonctionne, e. coli doit être transformé conjointement avec un plasmide d’exprimer la ligase tRNA aubergine. La transcription de plus-que-unit ELVd-dérivé est traitée par les ribozymes hammerhead embarqués et les monomères qui en résulte avec la termini appropriée sont reconnus et prospectés par la ligase tRNA conjointement exprimé. De cette façon, l’ARN d’intérêt est insérée dans un échafaudage circulaire très stable composé de la molécule circulaire viroïde. Cet ARN chimérique recombinant est très probablement encore stabilisé à l’intérieur des cellules d’Escherichia coli par la formation d’un complexe grâce à l’interaction avec la ligase d’ARNt ribonucléoprotéique. En utilisant cette méthode (voir le protocole ci-dessous), RNA aptamères, hairpin RNAs et autres ARN structurés ont été produites en quantités de dizaines de milligrammes par litre de culture d’e. coli dans des conditions de laboratoire réguliers et purifiée jusqu’à homogénéité prenant facilement avantage de circularité12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tout en cherchant la séquence ELVd et exigences de structure impliquées dans la reconnaissance de la ligase tRNA aubergine, nous avons remarqué que la co-expression de chacune des molécules dans les non-hôtes de e. coli a conduit à une accumulation importante inattendue du viroïde circulaire formules dans les cellules bactériennes,19. Nous avons compris que la grande accumulation du viroïde RNA chez e. coli est très probablement la conséquence d’exprimer conjointemen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions BIO2017-83184-R et BIO2017-91865-EXP de l’espagnol Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (fonds de cofinancement FEDER).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
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