Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico
Summary
Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.
Abstract
Existe un creciente interés en líquido biopsia para el diagnóstico de cáncer, el pronóstico y el seguimiento terapéutico, creando la necesidad de marcadores biológicos confiables y útiles para la práctica clínica. Aquí, presentamos un protocolo para extraer, retroceso transcribir y evaluar los niveles de expresión de miRNAs de muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal (CCR) de circulación. microRNAs (miRNAs) son una clase de RNAs no codificantes de 18-25 nucleotides en longitud que regulan la expresión de genes diana a nivel traduccional y juegan un papel importante, incluyendo el de la función de pro – y anti-angiogénicos, en la fisiopatología de varios órganos. miRNAs son estables en fluidos biológicos como el suero y el plasma, que los hace ideal circulación biomarcadores para cáncer diagnóstico, pronóstico y tratamiento la toma de decisiones y monitoreo. Extracción de miRNA de circulación se realizó mediante un método rápido y eficaz que consiste en métodos orgánicos y basados en la columna. Para miRNA retrotranscripción, se utilizó un procedimiento de múltiples paso que considera poliadenilación en 3′ y la ligadura de un adaptador a 5′ de los miRNAs maduros, seguido de pre-amplificación miRNA al azar. Seleccionamos un panel personalizado 24-miRNA a prueba por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y vistos los sondeos miRNA en placas personalizadas de matriz. Se realizaron carreras de placa de qRT-PCR en un sistema de PCR en tiempo real. Limpieza miRNAs de normalización fueron seleccionados utilizando el software GeNorm (v. 3.2). Los datos se analizaron utilizando el software de la suite de expresión (v 1.1) y se realizaron análisis estadísticos. El método demostró para ser confiable y técnicamente robusto y puede ser útil para evaluar los niveles de biomarcadores en muestras líquidas como el plasma o suero.
Introduction
CRC representa la tercera más frecuentemente diagnosticada la malignidad y la cuarta causa de muerte relacionada con cáncer en todo el mundo. Hasta la fecha, (B) el bevacizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y (C) el cetuximab o panitumumab (P), anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), han sido aprobados para tratamiento de primera línea en combinación con regímenes de quimioterapia (CT).
Las mutaciones en los genes K-ras y N-RAS son los biomarcadores clínicamente útiles sólo capaces de identificar pacientes que tienen menos probabilidades de beneficiarse de las CT basadas en anti-EGFR Aunque se han realizado varios estudios para buscar biomarcadores que son predictores de respuesta al TC de B, todavía hay una falta importante de drogas eficaces y confiables para su uso en la práctica clínica1.
miRNAs son RNAs pequeños (18-25 nucleotides en longitud) que regulan la traducción de genes diana y desempeñan un papel crucial en numerosos procesos fisiopatológicos, incluyendo la embriogénesis y la carcinogénesis. Estas moléculas son muy estables en fluidos biológicos como el plasma, suero, orina y esputo, que los hace robustos biomarcadores para muestreo no invasivo2. Usando un panel de miRNAs involucrados en la vía angiogénica, se procuró identificar circulando nuevos biomarcadores capaces de predecir el resultado clínico en pacientes con CCR metastático (mCRC) tratados con un régimen de CT basados en B.
Hemos analizado una serie de 52 mCRC pacientes tratados con CT B basado en el prospectivo multicéntrico aleatorizado fase III ensayo “italiano prueba en avanzado cáncer colorrectal” (ITACa). El presente Protocolo fue aprobado por el Comité de ética Local (Comitato Etico área Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo por lo dei de Studio e la Cura Tumori (IRST) IRCCS, Nº 674) en 19th septiembre de 2007. Todos los pacientes dieron consentimiento informado antes de la recogida de muestras de sangre. Para cada paciente, se recogieron muestras de sangre venosa antes del tratamiento y en la primera evaluación clínica (después de 8 semanas) para evaluar la expresión del miRNA de línea de base y su modulación durante el tratamiento en relación con los resultados de los pacientes.
A través de una búsqueda de la literatura, se seleccionaron 21 miRNAs correlacionados con el proceso angiogénico que son conocidos por ser detectable en el plasma humano: p ha-miR-107, ha-miR-126-3, ha-miR-145-5 p, p ha-miR-194-5, ha-miR-199a – 5p, ha-miR-200b – 3P, ha-miR-20b – 5p , ha-miR-21-5 p, p ha-miR-210-3, ha-miR-221-3 p, p ha-miR-24-3, p ha-miR-27a – 3P, ha-miR-29b – 3P, ha-miR-335-5, p ha-miR-424-5, ha-miR-497-5 p, p ha-miR – 520d – 3P, ha-miR-92a – 3P, ha-miR-17-5 y ha-miR-155-5 p. También seleccionamos p ha-miR-223-3 y ha-mir-484 para normalización endógena3,4,5,6y cel-miR-39 purificaron de C. elegans como un punto de normalización exógeno. Normalizar los datos se realizaron utilizando el método de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
La detección de circulación miRNAs presenta algunas dificultades técnicas porque las moléculas están presentes en niveles muy bajos en el plasma y su amplificación es químicamente un desafío dada su secuencia corta. Por estas razones, hemos seleccionado un procedimiento que considera la extracción orgánica con fenol y una metodología basada en la columna de fibra de vidrio. Extracción de miRNA de circulación es un tema candente en el área de líquido biopsia, y seleccionamos un kit comercial que ha demostrado ser uno de los más confiables en términos de cantidad y calidad de rendimientos recuperados7,8. Hemos seleccionado un protocolo para invertir transcriba miRNAs por la adición de un adaptador en 5′ y una cola de poly(A) a 3′ de lo miRNA maduro para mejorar la selectividad y especificidad de la reacción.
Dada la robustez del método, diseñamos personalizadas platos con sondas previamente manchadas para RT-PCR evaluar cada muestra por duplicado y análisis a 2 pacientes dentro de cada placa, como se muestra en la figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs son pequeños no-codificación RNAs (18-25 nucleotides en longitud) capaces de atar la región 3′ UTR de su objetivo de ARN mensajero e inhibiendo o lo degradantes. Así se pueden considerar los reguladores de expresión génica a nivel traduccional. En la última década, varios miRNAs se han correlacionado con cáncer iniciación y desarrollo, haciéndolos útiles biomarcadores clínicos para el diagnóstico, pronóstico y terapia. Protegido por RNasas, miRNAs están presentes en una forma estable en fluidos bio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue parcialmente financiado por Roche S.p.A. y la agencia italiana de medicamentos (AIFA).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
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