Обнаружение циркулирующего микроРНК пользовательские группы больных с метастатическим колоректальным раком
Summary
Мы представляем протокол для оценки выражения уровня циркулирующих микроРНК (интерферирующим) в образцах плазмы от больных раком. В частности мы использовали коммерчески доступных комплект для распространения Мирна извлечения и обратной транскрипции. Наконец мы проанализировали Группа 24 отдельных адаптивной, с использованием реального времени предварительно пятнистый зонд пользовательских пластины.
Abstract
Растет интерес к жидким биопсии для диагностики рака, прогноз и терапевтического мониторинга, создание потребность в надежной и полезной биомаркеров для клинической практики. Здесь мы представляем протокол для извлечения, реверс транскрибировать и оценить выражение уровня циркулирующих интерферирующим из плазмы образцы больных колоректальный рак (CRC). микроРНК (интерферирующим) являются класс некодирующих RNAs 18-25 нуклеотидов в длину, которые регулируют выражение генов-мишеней на уровне поступательные и играют важную роль, включая про – и анти ангиогенных функции, в предлежания из различные органы. интерферирующим являются стабильными в биологических жидкостях, например сыворотки и плазмы, которая делает их идеальным циркулирующих биомаркеров для рака, диагноз, прогноз и лечение решений и мониторинга. Циркулирующих Мирна извлечения проводилось с использованием быстрый и эффективный метод, который включает в себя как органических, так и на основе столбцов методологий. Для retrotranscription miRNA мы использовали многоступенчатый процедуру, которая считает сплайсингу на 3′ и перешнуровка переходник на 5′ Пожилая адаптивной, следуют случайных Мирна предварительного усиления. Мы выбрали пользовательскую панель 24-miRNA проверяемый количественных реального времени полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) и заметили Мирна зонды на массив пользовательских пластины. Мы исполняли qRT ПЦР плита работает на систему ПЦР в реальном времени. Уборка интерферирующим для нормализации были отобраны с использованием программного обеспечения GeNorm (v. 3.2). Данные были проанализированы с помощью выражения suite программного обеспечения (v 1.1) и статистические анализы. Метод оказался надежным и технически надежной и может быть полезным для оценки уровней биомаркеров в жидких проб например плазме или сыворотке.
Introduction
КПР является третьим наиболее часто диагноз злокачественных и четвертой причиной связанных с раком смерти во всем мире. На сегодняшний день, Бевацизумаб (B), моноклональные антитела, направленные против Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и cetuximab (C) или Панитумумаб (P), моноклональные антитела, направленные против рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), были одобрены для первой линии лечения в сочетании с схем химиотерапии (CT).
Мутации в генах K-RAS и N-РАН являются только клинически полезным биомаркеров, способных определять пациентов, которые наименее вероятно, воспользоваться на основе анти EGFR CT. Хотя было проведено несколько исследований для поиска биомаркеров, которые прогнозирования ответа на основе B CT, по-прежнему сохраняется существенный недостаток надежных и эффективных препаратов для использования в клинической практике1.
интерферирующим являются малые РНК (18-25 нуклеотидов в длину), которые регулируют перевод генов-мишеней и играть решающую роль в многочисленных процессах выкидышей, включая эмбриогенеза и канцерогенеза. Эти молекулы являются весьма стабильными в биологических жидкостях, например сыворотки/плазмы, мочи и мокроты, который делает их надежной биомаркеров для неинвазивной выборки2. С помощью панели интерферирующим участвующих в ангиогенных пути, мы стремились выявить новые циркулирующих биомаркеров, способных предсказать клинических исходов у больных с метастатическим CRC (mCRC) относились с режима на основе B CT.
Мы проанализировали серии 52 mCRC пациентов с B-основе КТ в пределах потенциальных многоцентрового рандомизированного Фаза III пробную» итальянского суда в расширенный колоректального рака» (ITACa). Настоящий Протокол был одобрен Комитетом по этике местных (Comitato Etico области Васта e Istituto Scientifico романьольское за Ло студия e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, № 674) на 19й сентября 2007. Все пациенты дал осознанного согласия до взятия пробы крови. Для каждого пациента были собраны пробы венозной крови до начала лечения и в первой клинической оценки (после 8 недель) для оценки базовых Мирна выражение и его модуляции во время лечения в отношении пациентов результат.
Через поиск литературы, мы выбрали 21 интерферирующим коррелирует с процессом ангиогенных, которые известны как обнаружить в плазме крови человека: имеет мир-107, имеет мир-126-3 p, имеет мир-145-5 p, имеет мир-194-5 p, имеет мир 199a – 5p, имеет мир 200b – 3p, имеет мир 20b – 5p , имеет мир-21-5 p, имеет мир-210-3 p, имеет мир-221-3 p, имеет мир-24-3 p, имеет мир 27А – 3p, имеет мир 29В – 3p, имеет мир-335-5 p, имеет мир-424-5 p, p имеет мир-497-5, имеет мир – 520d – 3p, имеет мир 92a – 3p, имеет мир-17-5 p и имеет мир-155-5 p. Мы также выбрали имеет мир-223-3 p и имеет мир-484 для эндогенного нормализации3,4,5,6и чел мир-39 очищенного от C. elegans как Спайк в экзогенных нормализации. Все данные нормировок были проведены с использованием метода ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
Выявление циркулирующих интерферирующим представляет некоторые технические трудности, поскольку молекулы присутствуют на очень низком уровне в плазме и их усиления химически сложной, учитывая их короткую последовательность. По этим причинам мы выбрали процедура, которая считает органической экстракции с фенолом и стекло волокна методологии на основе столбцов. Циркулирующих Мирна добыча является горячей темой в области жидкого биопсии, и мы выбрали показали, чтобы быть одним из самых надежных коммерческих комплект с точки зрения количества и качества восстановленных урожайности7,8. Мы выбрали протокол обратить вспять транскрибировать интерферирующим путем добавления адаптера на 5′ и poly(A) хвост к 3′ Зрелые Мирна повышения селективности и специфичность реакции.
С учетом надежности метода, мы разработаны пользовательские пластины с предварительно пятнистый зонды для RT-PCR для оценки каждого образца в двух экземплярах и проанализированы 2 больных в пределах каждой пластины, как показано на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
интерферирующим малы некодирующих РНК (18-25 нуклеотидов в длину) способны привязки 3′ УТР регионе их целевого РНК и ингибирования и/или унижающего его достоинство. Таким образом они могут рассматриваться в регуляторы выражения гена на уровне поступательное. В течение последнего десятил?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось частично Roche S.p.A. и итальянского агентства лекарственных средств (AIFA).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
