転移性大腸癌患者における循環マイクロ Rna カスタム パネルの検出
Summary
がん患者からの血漿サンプル マイクロ Rna (Mirna) の循環の表現のレベルを評価するためのプロトコルを提案します。特に、マイクロ Rna 抽出および逆のトランスクリプションを循環させるため市販のキットを使用しました。最後に、斑点を付けられた前のリアルタイム プローブ カスタム プレートを使用して 24 選択した Mirna のパネル分析を行った。
Abstract
関心が高まっているがん診断、予後及び治療モニタリングのための液体の生検の臨床練習のための信頼性の高い、有用なバイオ マーカーの必要性を作成します。紹介を展開する、プロトコル逆転写し、循環 (CRC) 大腸癌患者の血漿サンプルから Mirna の発現レベルを評価します。マイクロ Rna (Mirna) は翻訳レベルでの標的遺伝子の発現を調節しての生理病理学のプロおよび抗血管新生機能を含む、重要な役割を果たす長さ 18-25 のヌクレオチドの非コード Rna のクラス様々 な器官。Mirna は血清、血漿は、理想的な癌の診断、予後、治療の意思決定のため血漿中バイオ マーカーと監視にそれらをレンダリングなどの体液で安定しています。マイクロ Rna 抽出を循環を有機および列ベースの方法論では、迅速かつ効果的な方法を使用して行った。MiRNA retrotranscription 3′ と 5 ‘ ランダム miRNA 中古増幅に続いて、成熟 Mirna のアダプターの ligation 起こるを考慮したマルチ ステップの手順を使用しました。量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) によってテストする 24 miRNA カスタム パネルを選択し、配列カスタム プレートのマイクロ Rna プローブを発見します。リアルタイム PCR システム上で qRT PCR プレート動作を行った。(3.2) 対 GeNorm ソフトウェアを使用して正規化のハウスキーピング Mirna が選ばれました。式スイート ソフトウェア (v 1.1) を使用して、データを分析し、統計的分析を行った.このメソッドでは、信頼性と技術的に堅牢なことを証明し、血漿や血清などの液体試料中のバイオ マーカーのレベルを評価する役に立つかもしれません。
Introduction
CRC を表す 3 番目最も頻繁に悪性腫瘍と癌関連死の世界の 4 番目の原因を診断します。日には、承認されている、ベバシズマブ (B)、パニツムマブ (P)、上皮成長因子受容体 (EGFR) に対するモノクローナル抗体やセツキシマブ (C) 血管内皮増殖因子 (VEGF) に対するモノクローナル抗体ファーストライン治療レジメン (CT) と組み合わせて。
K ‐ RASおよびN-RAS遺伝子の突然変異が唯一の臨床的に有用なバイオ マーカー少なくとも抗 EGFR 基づく CT から恩恵を受ける可能性が高い患者を識別することができます。B ベース CT への応答の予測バイオ マーカーを検索するいくつかの研究を行った、まだ臨床実習1で使用するための信頼性の高い、効果的な薬の相当な欠乏があります。
Mirna は、標的遺伝子の翻訳を調節して胚発生と発がんを含む多数の physiopathological プロセスで重要な役割を果たす小さな Rna (18-25 のヌクレオチドの長さ) です。これらの分子は、血漿/血清、尿、喀痰、それらに非侵襲的サンプリング2に使用する堅牢なバイオ マーカーを描画するなど体液に非常に安定しました。識別するために血管新生の経路に関与する Mirna のパネルを使用して、目的とする B ベースの CT レジメンで治療新しい転移 CRC (mCRC) 症例の臨床経過を予測できるバイオ マーカーを循環します。
52 のシリーズを行った mCRC 患者 B ベース ct 内前向き多施設共同無作為化フェーズ III 試験「イタリア トライアルで高度な大腸癌」(イタカ).現在のプロトコルはローカル倫理委員会によって承認された (あたり率いる Etico エリア Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo lo スタジオ e ラ クーラ ・ デイ ・周辺 (IRST) IRCCS 号 674) 19th 2007 年 9 月に。すべての患者は、血液サンプルのコレクションの前にインフォームド コンセントを与えた。各患者の静脈血採取 (8 週間) 後の最初の臨床評価と治療前にベースライン miRNA 発現と患者のアウトカムに関連して治療中にその変調を評価します。
文献の検索、我々 はひと血漿中に検出する知られている 21 の miRNAs 血管新生のプロセスとの相関を選択: はミール 107、ミール-126 は 3 p ミール-145 が 5 p、ミール-194 は 5 p はミール-199a-5 p は-ミール-200b-3 p が-ミール-20b-5 p、、-ミール-21-5 p、ミール-210 が 3 p、ミール-221 が 3 p、ミール-24 が 3 p、がミール-27 a-3 p は-ミール-29 b-3、p は-ミール-335-5 p、ミール-424 が 5 p、ミール-497 が 5 p、はミール-520 d-3 p、がミール-92 a-3 p、ミール-17 は 5 p とは-ミール-155-5 p。我々 はまた、ミール-223 が 3 p を選択し、内生的正規化3,4,5,6ミールは 484 と cel-ミール-39 は外因性の正規化のスパイクとして線虫から精製します。2 ̂ ̄(ΔΔCt) メソッドを使用してすべてのデータ正規化を行った。
MiRNAs の循環の検出は、分子がプラズマで非常に低いレベルで存在と彼らの増幅が化学的に挑戦的な短いシーケンスを与えられたので、いくつかの技術的な問題を示します。これらの理由から、フェノール、有機抽出とガラス繊維の列ベースの方法論を考慮した手順を選択しました。マイクロ Rna 抽出を循環液生検の分野でホットな話題では、我々 は最も信頼性の高いであることを示している市販キットを選択した回復した利回り7,8の量と質の面で。我々 は逆にプロトコルを選択反応の特異性と選択性を高めるために 5′ と 3 ‘ 成熟 miRNA のポリ a テールでアダプターの追加による Mirna を書き写します。
メソッドの堅牢性を考えると、重複の各サンプルを評価するために RT-PCR 法の事前発見プローブ カスタム プレートを設計し、図 1に示すように、各プレート内 2 患者を分析.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mirna が小さい非コード Rna (18-25 のヌクレオチドの長さで) 彼らのターゲットのメッセンジャー RNA の 3′ UTR 領域をバインドおよび抑制および/またはそれを分解することができます。翻訳レベルで遺伝子式レギュレータ従って見なされます。過去 10 年間でいくつかの miRNAs は癌の開始とし、診断、予後、治療の役に立つ臨床バイオ マーカー開発に関連しました。MiRNAs は、RNases によって保護され…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究はロシュ社とイタリアの薬庁 (!) によって部分的に資金を供給されました。
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
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