Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti
Summary
Biz mikroRNA (miRNAs) dolaşan ifade düzeylerini değerlendirmek için bir protokol kanserli hastalarda plazma örnekleri mevcut. Özellikle, biz piyasada bir kit miRNA çıkarma ve ters transkripsiyon dolaşan için kullanılır. Son olarak, gerçek zamanlı önceden benekli sonda özel plakaları kullanarak 24 seçili miRNAs oluşan bir panel analiz ettik.
Abstract
Orada sıvı biyopsi için kanser tanı, teşhis ve tedavi kontrolü, ilgi klinik uygulaması için güvenilir ve yararlı biyolojik gereksinimini oluşturma artmaktadır. Burada, ayıklamak için bir iletişim kuralı mevcut ters uyarlamak ve kolorektal kanser (CRC) hastalarda plazma örneklerinden miRNAs dolaşan ifade düzeyini değerlendirin. MikroRNA (miRNAs) kodlamayan RNA’ların translasyonel düzeyinde hedef genlerin ifade düzenleyen ve pro – ve anti-anjiogenik işlevi, Fizyopatoloji da dahil olmak üzere önemli bir rol oynamaktadır 18-25 nükleotid uzunluğunda, sınıfıdır çeşitli organları. miRNAs serum ve onları ideal biyolojik kanser tanı, teşhis ve tedavi karar için dolaşan ve izleme işler plazma gibi biyolojik sıvı stabildir. MiRNA ayıklama dolaşan hem organik hem de sütun tabanlı yöntemleri içerir hızlı ve etkin bir yöntemle gerçekleştirildi. MiRNA retrotranscription için biz 3′ ve bir bağdaştırıcı, 5′ in rasgele miRNA öncesi amplifikasyon tarafından takip olgun miRNAs ligasyonu Poliadenilasyon dikkate alır bir çok adım yordam kullanılır. Nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) tarafından test edilecek, özel bir 24-miRNA bölmesi seçili ve miRNA probları dizi özel Tabaklarda gördü. Biz qRT-PCR plaka ishal üstünde bir gerçek zamanlı PCR sistemi uygulandı. Temizlik miRNAs normalleştirme için GeNorm yazılım (v. 3.2) kullanarak seçildi. Veri ifade suite yazılımı (v 1.1) kullanarak analiz edildi ve istatistiksel analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem güvenilir ve teknik olarak sağlam olduğu ortaya çıktı ve plazma ve/veya serum gibi sıvı örnekleri biyomarker düzeyleri değerlendirmek için yararlı olabilir.
Introduction
CRC temsil eden üçüncü en sık malignite ve dördüncü ölüm sebebi kanser ile ilgili dünya çapında tanısı. Bugüne kadar bevacizumab (B), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve cetuximab (C) veya panitumumab (P), monoklonal antikorlar karşı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), yönetmen karşı Monoklonal antikor onaylanmış olan birinci basamak tedavi kemoterapi (CT) rejimleri ile birlikte.
K-RAS ile N-RAS gen mutasyonlar tek klinik olarak yararlı biyolojik anti-EGFR tabanlı CT yararlanmak en az olan hastalar belirleme yeteneğine sahip olan Yanıt CT B tabanlı akıllı biyolojik aramak için çeşitli çalışmalar yapılmıştır rağmen hala güvenilir ve etkili ilaçların klinik pratikte1kullanmak için önemli bir eksikliği olduğunu.
miRNAs çeviri hedef genlerin düzenleyen ve embriyo ve karsinojenezis dahil olmak üzere çok sayıda Fizyopatolojik işlemlerinde çok önemli bir rol oynamak küçük RNA’lar (18-25 nükleotid uzunluğunda) vardır. Bu moleküller biyolojik sıvı plazma/serum, idrar ve non-invaziv örnekleme2için kullanmak için sağlam biyolojik işler balgam gibi son derece kararlı. MiRNAs anjiogenik yolu yer Masası, biz tanımlamak için amaçlayan yeni biyolojik metastatik CRC (mCRC) olan hastalarda klinik sonuçlar oluşabileceğini yetenekli dolaşan bir B tabanlı CT rejimi ile tedavi.
52 bir dizi analiz randomize potansiyel multicenter içinde B tabanlı CT ile tedavi edilen mCRC hastaların evre III deneme “İtalyan deneme içinde gelişmiş kolorektal kanser” (Itaca). Mevcut iletişim kuralı yerel Etik Komitesi tarafından kabul edildi (Comitato Etico alan Vasta e Istituto bilimsel Enstitüsü Romagnolo başına lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, No 674) 19th Eylül 2007 tarihinde. Tüm hasta Onam kanı örnek toplama önce verdi. Her bir hasta için Venöz kan örneği tedavi öncesi ve (sonra 8 hafta) ilk klinik değerlendirme, temel miRNA ifade ve hasta sonuç ile ilgili olarak tedavi sırasında onun modülasyon değerlendirmek için toplandı.
Edebiyat bir arama, biz insan plazmada tespit olduğu bilinmektedir anjiogenik işlemle ilişkili 21 miRNAs seçilmiş: vardır-miR-107, sahip-miR-126-3 p, vardır-miR-145-5 p, vardır-miR-194-5 p, vardır-miR-199a – 5p, vardır-miR-200b – 3p, vardır-miR-20b – 5p , vardır-miR-21-5 p, sahip-miR-210-3 p, sahip-miR-221-3 p, sahip-miR-24-3 p, vardır-miR-27a – 3p, vardır-miR-29b – 3p, vardır-miR-335-5 p, vardır-miR-424-5 p, vardır-miR-497-5 p, vardır-miR – 520d – 3p, vardır-miR-92a – 3p, vardır-miR-17-5 p ve vardır-miR-155-5 p. Biz de sahip-miR-223-3 p ve seçilen vardır-mir-484 endojen normalleştirme3,4,5,6ve cel-miR-39 spike bileşeni olarak eksojen normalleştirme için C. elegans arıtılmış. Tüm veri normalizations 2 ̂ ̄(ΔΔCt) yöntemiyle yapıldı.
MiRNAs dolaşan algılama molekülleri plazmada çok düşük düzeylerde varsa ve onların amplifikasyon kısa sırasına verilen kimyasal olarak zordur çünkü bazı teknik sorunlar sunar. Bu nedenlerden dolayı biz fenol ile organik çıkarma ve sütunlara göre bir cam elyaflı metodoloji dikkate alır bir yordam seçildi. MiRNA ayıklama dolaşan sıvı biyopsi alanında bir konu olduğunu ve biz en güvenilir olmak göstermiştir bir ticari kiti seçili tutar ve kurtarılan verimleri7,8kalite açısından. Biz tersine çevirmek için bir iletişim kuralı seçili selectivity geliştirmek için bir adaptör 5′ ve Poli(a) kuyruğu için 3′ olgun miRNA eklenmesi ve reaksiyon özgüllüğü tarafından miRNAs uyarlamak.
Sağlamlık yöntemi göz önüne alındığında, biz özel plakaları önceden benekli probları yinelenen her örnekte değerlendirmek RT-PCR ile tasarlanmış ve her plaka içinde 2 hasta şekil 1‘ de gösterildiği gibi analiz.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs küçük RNA’lar (18-25 nükleotid uzunluğunda) 3′ UTR bölge hedeflerinin mesajcı RNA bağlama ve inhibe ve/veya aşağılayıcı, yetenekli kodlamayan. Böylece gen ifade düzenleyiciler translasyonel düzeyde kabul edilebilir. Son on yılda birkaç miRNAs kanser başlatma ve geliştirme, tanı, teşhis ve tedavisi için yararlı klinik biyolojik geliştirmelerde ile ilişkili. RNases tarafından korunan, miRNAs kan, plazma, serum, idrar ve tükürük, potansiyel kullanışlılığı klinik pratikte<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada kısmen Roche S.p.A. ve İtalyan ilaç Ajansı (AIFA) tarafından finanse edildi.
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
