Påvisning af en cirkulerende mikroRNA brugerdefineret Panel hos patienter med metastatisk kolorektal Cancer
Summary
Vi præsenterer en protokol for at evaluere udtryk niveauer af cirkulerende mikroRNA (miRNAs) i plasmaprøver fra patienter. Navnlig, brugte vi et kommercielt tilgængeligt kit for cirkulerende miRNA udvinding og omvendt transkription. Endelig, vi analyseret et panel af 24 udvalgte miRNAs ved hjælp af real-time pre plettede sonde brugerdefinerede plader.
Abstract
Der stigende interesse i flydende biopsi for kræftdiagnose, prognose og terapeutiske overvågning, oprettelse af behovet for pålidelig og nyttige biomarkører for klinisk praksis. Vi præsenterer her, en protokol til at udtrække, reverse transskribere og evaluere udtryk niveauer af cirkulerende miRNAs fra plasmaprøver af patienter med tarmkræft (CRC). MicroRNA (miRNAs) er en klasse af ikke-kodende RNA’er af 18-25 nukleotider i længde, der regulerer udtryk for target gener på translationel niveau og spiller en vigtig rolle, herunder pro – og anti-angiogene funktion, i Patofysiologi af forskellige organer. miRNAs er stabile i biologiske væsker som serum og plasma, hvilket gør dem ideelle cirkulerende biomarkører for cancer diagnose, prognose og behandling beslutningstagning og overvågning. Cirkulerende miRNA udvinding blev udført ved hjælp af en hurtig og effektiv metode, der involverer både økologisk og kolonne-baserede metoder. For miRNA retrotranscription brugte vi en multi-trins procedure, der finder polyadenylation på 3′ og ligatur af et netværkskort på 5′ af den modne miRNAs, efterfulgt af tilfældige miRNA pre forstærkning. Vi valgte en 24-miRNA brugerdefineret panel skal testes ved kvantitative real-time polymerase kæde reaktion (qRT-PCR) og spottet miRNA sonder array brugerdefinerede plader. Vi udførte qRT-PCR pladen kører på en real-time PCR-System. Husholdning miRNAs for normalisering blev udvalgt ved hjælp af GeNorm software (v. 3.2). Data blev analyseret ved hjælp af udtrykket suite-software (version 1.1) og statistiske analyser blev udført. Metoden viste sig for at være pålidelig og teknisk robust og kunne være nyttigt at evaluere biomarkør niveauer i flydende prøver såsom plasma og/eller serum.
Introduction
CRC repræsenterer tredje hyppigst diagnosticeret malignitet og den fjerde årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. Til dato, er bevacizumab (B), et monoklonalt antistof rettet mod vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), og cetuximab (C) eller panitumumab (P), monoklonale antistoffer rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), blevet godkendt til første-linie behandling i kombination med kemoterapi (CT) regimer.
Mutationer i K-RAS og N-RAS gener er de eneste klinisk nyttige biomarkører i stand til at identificere patienter, der er mindst tilbøjelige til at drage fordel af anti-EGFR-baserede CT. Selv om flere undersøgelser er blevet gennemført for at søge efter biomarkører, der er prædiktive for respons på B-baserede CT, er der stadig en betydelig mangel på pålidelige og effektive lægemidler til brug i klinisk praksis1.
miRNAs er små RNA’er (18-25 nukleotider i længde), der regulerer oversættelse af target gener og spiller en afgørende rolle i mange physiopathological processer, herunder embryogenese og carcinogenese. Disse molekyler er yderst stabil i biologiske væsker såsom plasma/serum, urin og spyt, hvilket gør dem robuste biomarkører til brug for non-invasiv prøveudtagning2. Ved hjælp af et panel af miRNAs involveret i angiogene pathway, vi havde til formål at identificere nye cirkulerende biomarkører i stand til at forudsige kliniske resultater hos patienter med metastatisk CRC (mCRC) behandlet med en B-baserede CT regime.
Analyserede vi en serie af 52 mCRC patienter behandlet med B-baserede CT i den prospektive multicenter randomiseret fase III forsøg “italienske retssag i avanceret kolorektal Cancer” (ITACa). Denne protokol blev godkendt af det lokale etiske udvalg (Comitato Etico område Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, nr. 674) på 19th September 2007. Alle patienter gav informeret samtykke før blod prøve samling. For hver patient, blev venøse blodprøver indsamlet før behandling og ved den første klinisk evaluering (efter 8 uger) for at vurdere baseline miRNA udtryk og dets graduering under behandling i forhold til patienten resultat.
Gennem en søgning i litteraturen, har vi valgt 21 miRNAs korreleret med angiogene proces, der er kendt for at kunne påvises i humant plasma: har-miR-107, har-miR-126-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-194-5 p, har-miR-199a – 5p, har-miR-200b – 3p, har-miR-20b – 5p , har-miR-21-5 p, har-miR-210-3 p, har-miR-221-3 p, har-miR-24-3 p, har-miR-27a – 3p, har-miR-29b – 3p, har-miR-335-5 p, har-miR-424-5 p, har-miR-497-5 p, har-miR – 520d – 3p, har-miR-92a – 3p, har-miR-17-5 p og har-miR-155-5 p. Vi valgte også har-miR-223-3 p og har-mir-484 for endogene normalisering3,4,5,6, og cel-miR-39 renset fra C. elegans som en spike til eksogene normalisering. Alle data normalizations blev udført ved hjælp af metoden 2 ̂ ̄(ΔΔCt).
Påvisning af cirkulerende miRNAs præsenterer nogle tekniske vanskeligheder, fordi molekylerne er til stede på et meget lavt niveau i plasma og deres forstærkning er kemisk udfordrende givet deres kort sekvens. Af disse grunde har valgt vi en procedure, der finder både økologisk ekstraktion med phenol og en glas-fiber kolonne-baseret metode. Cirkulerende miRNA ekstraktion er et varmt emne i feltet af flydende biopsi, og vi valgte en kommerciel kit, der har vist sig for at være en af de mest pålidelige med hensyn til mængde og kvalitet af gendannede udbytter7,8. Vi valgte en protokol til at tilbageføre transskribere miRNAs ved tilsætning af et netværkskort på 5′ og en poly(A) hale til 3′ af den modne miRNA at øge selektiviteten og specificitet af reaktionen.
Givet robustheden af metoden, vi designet brugerdefinerede plader med pre plettede sonder til RT-PCR til at vurdere hver prøve i to eksemplarer og analyseret 2 patienter inden for hver plade, som vist i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs er små ikke-kodende RNA’er (18-25 nukleotider i længde) i stand til at bindende 3′ UTR region af deres mål messenger RNA og hæmmende og/eller nedværdigende det. De kan således betragtes gen expression lovgivere på translationel niveau. I det sidste årti, har flere miRNAs blevet korreleret med kræft indledning og udvikling, hvilket gør dem nyttige kliniske biomarkører for diagnose, prognose og terapi. Beskyttet af RNases, er miRNAs til stede i en stabil form i biologiske væsker som blod, plasma, serum, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse var delvist finansieret af Roche S.p.A. og den italienske medicin (AIFA).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
