Rilevamento di un pannello personalizzato di MicroRNA circolanti in pazienti con cancro colorettale metastatico
Summary
Vi presentiamo un protocollo per valutare i livelli di espressione di microRNA (Mirna) di circolazione nei campioni del plasma dai malati di cancro. In particolare, abbiamo utilizzato un kit disponibile in commercio per estrazione di miRNA e trascrizione d’inversione di circolazione. Infine, abbiamo analizzato un panel di miRNA selezionati 24 utilizzando targhe personalizzate in tempo reale sonda pre-maculato.
Abstract
Vi è crescente interesse nella biopsia liquida per cancro diagnosi, prognosi e monitoraggio terapeutico, creando la necessità di biomarcatori affidabili e utili per la pratica clinica. Qui, presentiamo un protocollo per estrarre, reverse trascrivere e valutare i livelli di espressione di Mirna da campioni di plasma di pazienti con cancro colorettale (CRC) di circolazione. i microRNA (Mirna) sono una classe di RNA non codificanti di 18-25 nucleotidi di lunghezza che regolano l’espressione dei geni bersaglio a livello traduzionale e svolgono un ruolo importante, compreso quello della funzione di pro – e anti-angiogenici, nella fisiopatologia delle vari organi. i miRNA sono stabili nei fluidi biologici come siero e plasma, che li rende ideale circolanti biomarcatori per il processo decisionale di diagnosi, prognosi e trattamento di cancro e monitoraggio. Estrazione di miRNA in circolazione è stato effettuato usando un metodo rapido ed efficace che coinvolge metodologie biologiche e basata su colonne. Per retrotrascrizione di miRNA, abbiamo utilizzato una procedura multi-step che considera poliadenilazione al 3′ e la legatura di un adattatore a 5′ dei miRNA maturi, seguiti pre-dall’amplificazione miRNA casuale. Abbiamo selezionato un pannello personalizzato 24-miRNA per essere testato da reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) e macchiato le sonde miRNA su targhe personalizzate matrice. Abbiamo effettuato qRT-PCR piastra viene eseguito su un sistema di PCR in tempo reale. Le pulizie miRNA per normalizzazione sono stati selezionati utilizzando il software GeNorm (v. 3.2). I dati sono stati analizzati utilizzando Expression suite software (v 1.1) e le analisi statistiche sono state eseguite. Il metodo ha dimostrato di essere affidabile e tecnicamente robusto e potrebbe essere utile per valutare i livelli di biomarcatore in campioni liquidi come plasma e/o del siero.
Introduction
CRC rappresenta il terzo più frequentemente diagnosticata la malignità e la quarta causa di morte per cancro in tutto il mondo. Ad oggi, (B) il bevacizumab, un anticorpo monoclonale diretto contro il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) e (C) di cetuximab o panitumumab (P), anticorpi monoclonali diretti contro il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), sono stati approvati per trattamento di prima linea in combinazione con regimi di chemioterapia (CT).
Mutazioni dei geni K-RAS e N-RAS sono i biomarcatori clinicamente utili soli in grado di identificare i pazienti che sono meno probabili trarre giovamento da basati su anti-EGFR CT. Anche se parecchi studi sono stati condotti per la ricerca di biomarcatori che sono predittivi di risposta al CT basato su B, c’è ancora una sostanziale mancanza di farmaci affidabile ed efficace per l’uso nella pratica clinica1.
i miRNA sono piccole molecole di RNA (18-25 nucleotidi di lunghezza) che regolano la traduzione dei geni bersaglio e svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi fisiopatologici, tra cui l’embriogenesi e carcinogenesi. Queste molecole sono altamente stabili nei liquidi biologici come plasma/siero, urina e dell’espettorato, che li rende robusti biomarcatori da utilizzare per il campionamento non invasivo2. Utilizzando un pannello di miRNA coinvolti nel pathway angiogenici, abbiamo mirato a identificare circolanti nuovi biomarcatori in grado di predire il risultato clinico in pazienti con CRC metastatico (mCRC) trattati con un regime di CT basato su B.
Abbiamo analizzato una serie di 52 mCRC pazienti trattati con CT B-base entro il prospettico multicentrico randomizzato di fase III prova “Italiano Trial in Advanced cancro colorettale” (ITACa). Il presente protocollo è stato approvato dal comitato etico locale (Comitato Etico Area Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, n. 674) su 19th settembre 2007. Tutti i pazienti hanno dato consenso informato prima di raccolta del campione di sangue. Per ogni paziente, campioni di sangue venosi sono stati raccolti prima del trattamento e alla prima valutazione clinica (dopo 8 settimane) per valutare l’espressione dei miRNA basale e la sua modulazione durante il trattamento in relazione al risultato paziente.
Attraverso una ricerca della letteratura, abbiamo selezionato 21 miRNAs correlato con il processo angiogenetico che sono noti per essere rilevabile nel plasma umano: ha-miR-107, ha-miR-126-3 p, ha-miR-145-5 p, p ha-miR-194-5, ha-miR-199a – 5p, ha-miR-200b – 3P, ha-miR-20b – 5p , ha-miR-21-5 p, ha-miR-210-3 p, p ha-miR-221-3, ha-miR-24-3 p, p ha-miR-27a – 3P, ha-miR-29b – 3P, ha-miR-335-5, ha-miR-424-5 p, ha-miR-497-5 p, p ha-miR – 520d – 3P, ha-miR-92a – 3P, ha-miR-17-5 e ha-miR-155-5 p. Abbiamo inoltre selezionato ha-miR-223-3 p e ha-mir-484 per normalizzazione endogeno3,4,5,6e cel-miR-39 purificato dal c. elegans come spike-in per la normalizzazione esogeno. Le normalizzazioni di tutti i dati sono state eseguite utilizzando il metodo di ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
La rilevazione di Mirna in circolazione presenta alcune difficoltà tecniche, perché le molecole sono presenti a livelli molto bassi nel plasma e la loro amplificazione è chimicamente impegnativo dato loro breve sequenza. Per queste ragioni, abbiamo selezionato una procedura che ritiene sia organico estrazione con fenolo e una metodologia basata su colonna di fibra di vetro. Estrazione di miRNA di circolazione è un tema caldo nel campo della biopsia liquida, e abbiamo scelto un kit commerciale che ha dimostrato di essere uno dei più affidabili in termini di quantità e qualità di rendimenti recuperati7,8. Abbiamo selezionato un protocollo per invertire trascrivere Mirna dall’aggiunta di un adattatore a 5′ e una coda di poli (a) a 3′ del quieto maturo per migliorare la selettività e specificità della reazione.
Data la robustezza del metodo, abbiamo progettato targhe personalizzate con sonde pre-macchiati per RT-PCR valutare ciascun campione in duplicato e analizzati 2 pazienti all’interno di ogni piatto, come mostrato nella Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
i miRNA sono piccoli non-codificazione RNAs (18-25 nucleotidi di lunghezza) in grado di associazione regione 3′ UTR del loro obiettivo di RNA messaggero e d’inibizione e/o degradanti si. Possono quindi essere considerati regolatori di espressione genica a livello traduzionale. Nell’ultimo decennio, diversi miRNA sono stati correlati con l’inizio del cancro e lo sviluppo, che li rende utile clinici biomarcatori per la diagnosi, prognosi e terapia. Protetto da RNasi, Mirna sono presenti in una forma stabile nei liquidi bio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato parzialmente finanziato da Roche s.p.a. e l’agenzia italiana di farmaci (AIFA).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
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