Påvisning av en sirkulerende MicroRNA tilpasset Panel hos pasienter med metastatisk tykktarmskreft
Summary
Vi presenterer en protokoll for å evaluere uttrykk nivåene av sirkulerende microRNA (miRNAs) i plasmaprøver fra pasienter. Spesielt brukte vi en kommersielt tilgjengelig kit for sirkulerende miRNA utvinning og omvendt transkripsjon. Til slutt, vi analyserte et panel av 24 valgte miRNAs ved hjelp av sanntids pre flekkete sonde egendefinerte plater.
Abstract
Det er økende interesse i flytende biopsi for kreftdiagnose, prognose og terapeutiske overvåking, opprette behovet for pålitelig og nyttig biomarkers for klinisk praksis. Her presenterer vi en protokoll trekke ut revers transkribere og evaluere uttrykk nivåene av sirkulerende miRNAs fra plasmaprøver av pasienter med tykktarmskreft (CRC). microRNAs (miRNAs) er en klasse av ikke-koding RNAs av 18-25 nukleotider i lengde som regulerer uttrykket av målet gener på translasjonsforskning nivå og spiller en viktig rolle, inkludert pro – og anti-angiogenic funksjon, i physiopathology av ulike organer. miRNAs er stabile i biologiske væsker som serum og plasma, som gjør dem ideelle sirkulerende biomarkers for kreft diagnose, prognose og behandling beslutningstaking og overvåking. Sirkulerende miRNA utvinning ble utført med en rask og effektiv metode som involverer både organisk og kolonne-baserte metoder. For miRNA retrotranscription brukte vi en flertrinns prosedyre som vurderer polyadenylation på 3 og ligation av et kort på 5′ av det eldre miRNAs, etterfulgt av tilfeldige miRNA pre forsterkning. Vi valgte et 24-miRNA egendefinerte panel å bli testet av kvantitative sanntids polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR) og oppdaget miRNA sonder på matrisen egendefinerte plater. Vi utførte qRT PCR plate kjører på en sanntids PCR-System. Rengjøring miRNAs for normalisering ble valgt med GeNorm programvare (v. 3.2). Dataene ble analysert bruker uttrykket suite programvare (v 1.1) og statistiske analyser ble utført. Metoden viste seg for å være pålitelige og teknisk robust og kan være nyttig å vurdere biomarkør nivåer i flytende prøver som plasma og/eller serum.
Introduction
CRC representerer tredje mest diagnosen kreft og fjerde dødsårsaken kreft relatert over hele verden. Hittil er bevacizumab (B), et monoklonalt antistoff rettet mot vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og cetuximab (C) eller panitumumab (P), monoklonale antistoffer rettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), godkjent for første-linje behandling i kombinasjon med kjemoterapi (CT) regimer.
Mutasjoner i K-RAS og N-RAS gener er de eneste klinisk nyttig biomarkers kan identifisere pasienter som er minst sannsynlig å ha nytte av anti-EGFR-baserte CT. Selv om flere studier har vært gjennomført for å søke etter biomarkers som er prediktive for svar på B-baserte CT, er det fortsatt en betydelig mangel på pålitelig og effektiv narkotika for bruk i klinisk praksis1.
miRNAs er små RNAs (18-25 nukleotider i lengde) som regulerer oversettelsen av målet gener og spiller en avgjørende rolle i mange physiopathological prosesser, inkludert embryogenesis og kreft. Disse molekylene er svært stabile i biologiske væsker som plasma/serum, urin og sputum, som gjengir dem robust biomarkers bruke for ikke-invasiv prøvetaking2. Bruker et panel av miRNAs involvert i angiogenic veien, vi som mål å identifisere nye sirkulerende biomarkers kan forutsi kliniske utfallet hos pasienter med metastatisk CRC (mCRC) behandlet med en B-baserte CT diett.
Vi analysert en rekke 52 mCRC pasienter behandlet med B-baserte CT innenfor den potensielle multisenter tilfeldiggjort fase III prøve “italiensk Trial i avansert Colorectal Cancer” (ITACa). Nåværende protokollen ble godkjent av den lokale etikk (Comitato Etico området Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (første) IRCCS, nr. 674) på 19th September 2007. Alle pasienter ga samtykke før blod prøvetaking. For hver pasient, ble venøs blodprøver samlet før behandling og den første kliniske vurderingen (etter 8 uker) for å evaluere planlagte miRNA uttrykk og dens modulering under behandling i forhold til pasient utfall.
Gjennom et søk litteratur, vi valgte 21 miRNAs korrelert med angiogenic prosessen som er kjent for å være synlig i humant plasma: har-miR-107, har-miR-126-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-194-5 p, har-miR-199a – 5p, har-miR-200b – 3p, har-miR-20b – 5p , har-miR-21-5 p, har-miR-210-3 p, har-miR-221-3 p, har-miR-24-3 p, har-miR-27a – 3p, har-miR-29b – 3p, har-miR-335-5 p, har-miR-424-5 p, har-miR-497-5 p, har-miR – 520d – 3p, har-miR-92a – 3p, har-miR-17-5 p og har-miR-155-5 p. Vi valgte også har-miR-223-3 p og har-mir-484 i endogene normalisering3,4,5,6, og cel-miR-39 renset fra C. elegans som et topp for eksogene normalisering. Alle data normalizations ble utført med metoden 2 ̂ ̄(ΔΔCt).
Gjenkjenning av sirkulerende miRNAs presenterer noen tekniske problemer fordi molekylene er tilstede på svært lave nivåer i plasma og deres forsterkning er kjemisk utfordrende gitt deres kort sekvens. For disse grunner valgte vi en prosedyre som vurderer både organisk ekstraksjon med fenol og glassfiber kolonnen-basert metode. Circulating miRNA utvinning er et hett tema innen flytende biopsi, og vi merket en kommersiell kit som har vist seg for å være en av de mest pålitelige mengden og kvaliteten på gjenopprettede gir7,8. Vi valgte en protokoll for å reversere transkribere miRNAs med tillegg av en adapter på 5′ og en poly(A) hale å 3′ av den eldre miRNA å forbedre selektivitet og spesifisitet av reaksjonen.
Gitt robust metoden, vi designet egendefinerte plater med pre flekkete sonder for RT PCR å vurdere hvert utvalg i duplikat og analysert 2 pasienter i hver plate, som vist i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs er små ikke-koding RNAs (18-25 nukleotider i lengde) kan binding 3 UTR regionen av deres mål budbringer RNA og hemme og/eller nedverdigende den. De kan dermed betraktes gene expression regulatorer på translasjonsforskning nivå. I det siste tiåret, har flere miRNAs vært korrelert med kreft initiering og utvikling, noe som gjør dem nyttige klinisk biomarkers for diagnose, prognose og behandling. Beskyttet av RNases, er miRNAs tilstede i et stabilt skjema i biologiske væsker som blodet, plasma, serum, urin og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien var delvis finansiert av Roche S.p.A. og italienske legemidler Agency (AIFA).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
