À l’aide d’un bactérie pathogène à sonde pour réponses cellulaires et organismique au niveau de l’hôte
Summary
Nous décrivons les deux tests in vitro et in vivo de l’infection qui peuvent être utilisés pour analyser les activités des facteurs de l’hôte-codage.
Abstract
Il existe une variété de stratégies de bactéries pathogènes emploient pour survivre et proliférer une fois à l’intérieur de la cellule eucaryote. Les pathogènes dits « cytosoliques » (monocytogenes de Listeria, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensiset Rickettsia SPP.) avoir accès dans le cytosol des cellules infectées par physiquement et par voie enzymatique dégrade la membrane vacuolaire primaire. Une fois dans le cytosol, ces agents pathogènes se multiplient tant que génèrent des forces mécaniques suffisantes pour pénétrer la membrane plasmique de la cellule hôte afin d’infecter de nouvelles cellules. Ici, nous montrons comment cette étape terminale du cycle cellulaire infection de L. monocytogenes (Lm) peut être quantifié par les dosages d’unité formant colonie et cytométrie en flux et donner des exemples de comment les deux effets de facteurs encodés en agent pathogène et hôte ceci processus. Nous montrons également une correspondance étroite de Lm dynamique de l’infection des cellules cultivées infectés in vitro et celles des cellules hépatiques provenant de souris infectés in vivo. Ces dosages selon les fonctions sont relativement simples et peuvent être facilement transposés pour écrans de haut débit basé sur la découverte de modulateurs de la fonction des cellules eucaryotes.
Introduction
Axée sur l’infection des modèles expérimentaux sont intrinsèquement difficiles en raison de leur dépendance sur les conditions initiales d’état de l’hôte et pathogène, les différentes stratégies d’infection pathogène et la difficulté d’attribuer pathogène et hôte-processus axés sur basé sur les résultats. La bactérie Listeria monocytogenes (Lm) est devenu un pathogène idéal pour sonder les réactions de défense de l’hôte en raison de sa traçabilité génétique et microbiologique, sa stratégie d’infection cellulaire rapide et processive et le relativement claire relation entre les phénotypes de ses niveaux cellulaires et organismique infection. L’infection cellulaire de Lm passe par quatre phases distinctes1: (i) invasion cellulaire qui se termine par Lm être enfermé dans une vacuole ; (ii) Lm-a ordonné la dissolution de la membrane de la vacuole et libération de Lm dans le cytosol ; (iii) réplication d’intracytosolic ; et (iv) la pénétration physique de la membrane plasmique qui entraîne soit l’infection des cellules directement adjacentes (par exemple dans une feuille épithéliale) ou, dans les cellules solitaires, libération de Lm dans le milieu extracellulaire. Chacune de ces phases sont promus par spécifique Lm-codé facteurs (appelés « facteurs de virulence ») qui, lors de la suppression, causer des infections congénitales chez modèles cellulaires et animaux. Cette stratégie d’infection générale a évolué indépendamment par un certain nombre des dits pathogènes « cytosolique »2.
Tests d’unité (CFU) formatrices sont largement utilisés pour évaluer les deux études in vitro (c.-à-d., cellulaire) ainsi qu’in vivo (c.-à-d. organismique) résultats infection. En plus de leur grande sensibilité, notamment pour les infections in vivo, UFC essais fournissent un affichage sans ambiguïté l’invasion de l’agent pathogène et survie intracellulaire/prolifération. CFU dosages ont été largement utilisées pour analyser fois Lm et hôte déterminants de cellules qui ont une incidence d’infection. Aussi instructif que ces études préalables ont été d’analyser l’invasion cellulaire et réplication intracytosolic, UFC dosages ont pas, au meilleur de notre connaissance, été utilisés pour suivre la quatrième phase du processus d’infection Lm : évasion cellulaire. Nous décrivons ici relativement simples moyens d’évacuation comment cellulaire (ci-après dénommée « émergence ») peuvent être contrôlés par dosage de l’UFC (ainsi que par cytométrie en flux) et voir l’exemples de comment ces deux facteurs encodés en agent pathogène et hôte réglementent cette phase de la Lm cycle d’infection. L’analyse de la phase terminale du cycle cellulaire Lm infection peut rendre possible d’identifier l’agent pathogène supplémentaire et des activités et des facteurs d’infection spécifique cellule hôte.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison de son programme d’infection cellulaire rapide et processive, Lm est un pathogène idéal pour sonder les activités cellulaires qui ont une incidence de l’infection. Un certain nombre de facteurs de l’hôte ont été identifié qui soit positivement, soit négativement affecter Lm infection cellulaire11,12,13,14. Deux de ces facteurs caractérisés dans notre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
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