Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten
Summary
Wir beschreiben beide in vitro und in vivo Infektion-Assays, die verwendet werden können, um die Aktivitäten des Host-Codierung Faktoren zu analysieren.
Abstract
Es gibt eine Vielzahl von Strategien, die bakterielle Krankheitserreger zu beschäftigen, um zu überleben und vermehren sich einmal im Inneren der eukaryotischen Zelle. Die so genannte “cytosolischen” Erreger (Listeria Monocytogenes, Shigella Flexneri Burkholderia Pseudomallei, Francisella Tularensisund Rickettsien spp.) erhalten Sie Zugriff auf die infizierte Zelle Zytosol durch physisch und enzymatisch erniedrigender die primäre Vacuolar-Membran. Einmal in das Zytosol, diese Erreger sowohl vermehren sowie generieren ausreichende mechanische Kräfte, die Plasmamembran der Wirtszelle zu durchdringen, um neue Zellen zu infizieren. Hier zeigen wir, wie dieses terminal Schritt von den zellulären Infektionszyklus von L. Monocytogenes (Lm) von koloniebildenden Einheit Assays und Durchflusszytometrie quantifiziert werden kann und geben Beispiele dafür, wie die beiden Erreger – und Host-codierte Faktoren Auswirkungen dieses Prozesses. Wir zeigen auch eine enge Übereinstimmung von Lm -Infektion Dynamik der kultivierten Zellen infiziert in-vitro- und denen der hepatischen Zellen aus Mäusen infiziert in-vivo. Diese Funktion basierende Assays sind relativ einfach und können leicht für Entdeckung-basierte Hochdurchsatz-Bildschirme für Modulatoren der eukaryotic Zelle Funktion skaliert werden.
Introduction
Infektion-basierte experimentelle Modelle sind von Natur aus schwierig wegen ihrer Abhängigkeit von der Staat Startbedingungen der Host und Erreger, die verschiedenen Erreger Infektion Strategien und die Schwierigkeiten bei der Zuschreibung von Erreger und Wirt-gesteuerte Prozesse anhand der Ergebnisse. Das Bakterium Listeria Monocytogenes (Lm) ist eine ideale Erreger, Wirt Verteidigung Antworten wegen seine genetische und mikrobiologische Lenkbarkeit, seine schnelle und prozessualen zelluläre Infektion Strategie und relativ klar Sonde geworden. Beziehung zwischen der zellulären und organismische Ebene Infektion Phänotypen. Die zelluläre Infektion von Lm durchläuft vier Phasen1: (i) zellulären Invasion, die mit Lm wird eingeschlossen in einer Vakuole; schließt (Ii) Lm-Regie Auflösung der Vakuole Membran und Freisetzung von Lm in das Zytosol; (Iii) Intracytosolic Replikation; und (iv) körperliche Penetration der Plasmamembran, das ergibt sich entweder die Infektion der direkt benachbarten Zellen (z. B. in einem epithelialen Blatt) oder in einsamen Zellen, Freisetzung von Lm in das extrazelluläre Milieu. Jede dieser Phasen werden gefördert durch spezifische Lm-Faktoren (bezeichnet als “Virulenzfaktoren”) kodiert, wenn gelöscht, verursachen Infektion Mängel in zellulären und tierischen Modellen. Diese Allgemeininfektion Strategie hat unabhängig von einer Reihe von sogenannten “cytosolischen” Krankheitserreger2entwickelt worden.
Koloniebildenden Einheit (KBE) Assays werden häufig eingesetzt, um sowohl in-vitro-bewerten (d. h. zellulären) als auch in vivo (d. h. Organismische) Infektion Ergebnisse. Neben ihrer hohen Empfindlichkeit, besonders für in-vivo-Infektionen bieten KBE-Assays eine eindeutige Anzeige für Erreger Invasion und intrazelluläre überleben/Verbreitung. KBE-Assays wurden ausgiebig zur Lm und Host Zelle Determinanten zu analysieren, die Infektion auswirken. So informativ, wie diese früheren Studien gewesen, zellulären Invasion und Intracytosolic Replikation zu analysieren, KBE-Assays nicht, nach bestem Wissen und Gewissen, wurden verwendet, um die vierte Phase des Lm -Infektion-Prozesses zu verfolgen: zelluläre entkommen. Hier beschreiben wir relativ einfach, wie zelluläre Fluchtwege (nachfolgend “Entstehung”) lässt sich durch KBE-Assay (sowie durch Durchflusszytometrie) und zeigen Beispiele wie die beiden Erreger – und Host-codierte Faktoren regulieren diese Phase der Lm Infektionszyklus. Die Analyse der terminalen Phase des zellulären Lm -Infektionszyklus besteht dann die Möglichkeit, zusätzliche Erreger und Wirt Zelle Infektion-spezifische Faktoren und Aktivitäten zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund seiner schnellen und prozessualen zelluläre Infektion Programm ist Lm eine ideale Erreger, zelluläre Aktivitäten zu erforschen, die Infektion auswirken. Eine Reihe von Host Faktoren wurden identifiziert, die entweder positiv oder negativ Lm zelluläre Infektion11,12,13,14 beeinflussen. Zwei solche host Faktoren gekennzeichnet, die in unserem Labor Perforin-2 und de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
