Summary

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Descrevemos dois ensaios in vitro e in vivo de infecção que podem ser usados para analisar as atividades dos fatores do hospedeiro-codificação.

Abstract

Há uma variedade de estratégias de patógenos bacterianos empregam para sobreviver e proliferar uma vez dentro da célula eucariótica. Os chamados ‘citosólico’ patógenos (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) ter acesso para o citoplasma da célula infectada pelo fisicamente e enzimaticamente degradante a membrana vacuolar primária. Uma vez no citosol, estes patógenos proliferam tanto geram forças mecânicas suficientes para penetrar a membrana plasmática da célula hospedeira para infectar novas células. Aqui, nós mostramos como essa etapa terminal do ciclo celular de infecção de L. monocytogenes (Lm) pode ser quantificada por citometria de fluxo e ensaios de unidade formadoras e dar exemplos de como ambos impacto de fatores patógeno e hospedeiro codificado – isto processo. Também mostramos uma estreita correspondência de Lm dinâmica de infecção das células cultivadas infectados in vitro e os de células hepáticas, derivadas de ratos infectados in vivo. Estes ensaios baseados em função são relativamente simples e podem ser facilmente ampliados para telas de alta produtividade baseada na descoberta de moduladores da função da célula eucariótica.

Introduction

Infecção com base em modelos experimentais são inerentemente desafiadoras devido a sua dependência sobre as condições de estado inicial do hospedeiro e patógeno, as várias estratégias de infecção do patógeno e a dificuldade de atribuir o patógeno e hospedeiro-orientado a processos com base em resultados. A bactéria Listeria monocytogenes (Lm) tornou-se um patógeno ideal para sondar as respostas de defesa do hospedeiro por causa de sua rastreabilidade genética e microbiológica, sua estratégia de infecção celular rápida e processive e relativamente clara relação entre seus fenótipos de infecção celular e organísmica-nível. A infecção celular de Lm procede por quatro fases distintas1: (i) invasão celular que conclui com Lm sendo colocadas dentro de um vacúolo; (ii) Lm-dirigido a dissolução da membrana do vacúolo e libertação de Lm no citosol; (iii) intracytosolic replicação; e (iv) penetração física da membrana plasmática que resulta na infecção de células diretamente adjacentes (tais como uma folha epitelial) ou, em celas solitárias, lançamento do Lm para o meio extracelular. Cada uma destas fases são promovidos pelo específico Lm-codificado fatores (referidos como ‘fatores de virulência’) que, quando eliminado, causar defeitos de infecção em modelos celulares e animais. Esta estratégia de infecção geral tem sido evoluiu de modo independente por vários dos chamados patógenos ‘citosólica’2.

Formadoras de Colônia (UFC) de unidade ensaios são amplamente empregados para avaliar ambos in vitro (ou seja, celulares), bem como in vivo (ou seja, organísmica) resultados de infecção. Além de sua alta sensibilidade, particularmente para infecções em vivo, CFU ensaios fornecem uma leitura ambígua para invasão do patógeno e sobrevivência/proliferação intracelular. CFU ensaios têm sido utilizados extensivamente para analisar os determinantes de célula Lm e o anfitrião que impactam a infecção. Tão informativa como estes estudos prévios foram analisar a invasão celular e replicação de intracytosolic, ensaios de UFC não, o melhor de nosso conhecimento, foram utilizados para acompanhar a quarta fase do processo de infecção de Lm : fuga de celular. Aqui, descrevemos relativamente simples meios de evacuação como celular (doravante referida como ’emergência’) podem ser monitorados por meio de ensaio CFU (bem como por citometria de fluxo) e mostrar exemplos de como os dois fatores do patógeno e hospedeiro codificado – regulam esta fase da Lm ciclo de infecção. A análise da fase terminal do ciclo celular Lm infecção pode tornar possível identificar atividades e fatores de infecção específica de célula do hospedeiro e patógeno adicional.

Protocol

Os ratos foram tratados com humanidade em conformidade com todas as directrizes do governo apropriado para o cuidado e uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde e seu uso foi aprovados para este estudo todo pelo cuidado Animal institucional Universidade de Miami e o Comitê de uso (protocolo 16-053). 1. preparar células para a infecção Propagar o rato macrófago-como a linha celular 264.7 crus em meios de cultura de tecido DMEM suplementados com 10% de soro …

Representative Results

Avaliar o papel do patógeno e hospedeiro-codificado fatores impactando infecção celularUsando as condições de infecção descritas acima, 0,15% da entrada do selvagem-tipo Lm é recuperado após 1,5 h de incubação co com macrófagos cultivados (Figura 1A). No subsequente 1,5 h de incubação co (3h pós infecção, hpi), houve um 4-fold aumento na recuperação de viável Lm e de 3 a 6 hpi, houve …

Discussion

Devido a seu programa de infecção celular rápida e processive, Lm é um patógeno ideal para sondar celulares atividades que impactam a infecção. Foram identificada uma série de fatores do hospedeiro que positivamente ou negativamente afetar Lm infecção celular11,12,13,14. Dois desses hospedam fatores caracteriza-se em nosso laboratório, perforina-2 e o inibidor de He…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACK Lysing Buffer Gibco  A1049201
ArC Amine Reactive Compensation Beads  Life Technologies A10346
BHI (Brain Heart Infusion) broth EMD Milipore 110493
Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Collagenase D Roche 11088858001
DMEM media  Gibco  11965-092
FACS tubes  BD Falcon 352054
FBS – Heat Inactivated  Sigma-Aldrich F4135-500ML
Hanks’ Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H6648-6X500ML
LB agar Grow Cells MS MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies L349S9
Rhodamine Phalloidin  Thermo Fischer R415
SP6800 Spectral Analyzer Sony
Syringe 28G 1/2" 1cc BD 329461
TPP Tissue Culture 48 Well Plates  MIDSCI TP92048
TPP Tissue Culture 6 Well Plates  MIDSCI TP92406
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
Antigen
CD11b  Biolegend Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70
CD11c Biolegend Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418
CD45 Biolegend Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80 Biolegend Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead Invitrogen Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100
Ly6C Biolegend Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II Biolegend Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1 Biolegend Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136

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Cite This Article
Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo, N., Schesser, K. Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (144), e58775, doi:10.3791/58775 (2019).

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