إنتاج ألياف المصفوفة خارج الخلية عبر الألياف المجوفة الذبيحة غشاء الخلية والثقافة
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج الألياف مصفوفة كاملة من خارج الخلية المستهدفة لإصلاح الجرح التي مناسبة للتقييم السريري كجزء من زرع السقالة التجدد. هذه الألياف التي تنتجها ثقافة الليفية في أغشية الألياف الجوفاء والمستخرجة بواسطة انحلال الأغشية.
Abstract
تصميم السقالات المستمدة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) قد مدفوعة مصلحة كبيرة في الطب لإمكاناتها في التعجيل بالجرح بالإغلاق والشفاء. استخراج المصفوفة خارج الخلية من التليف خلية الثقافات في المختبر قدرة كامنة لجيل من إدارة المحتوى في المؤسسة من خطوط الخلايا البشرية-ويحتمل أن تكون خاصة بالمريض والتقليل من الوجود [ابيتوبس] إكسينوجينيك الذي أعاق في السريرية نجاح بعض المنتجات الموجودة في إدارة المحتوى في المؤسسة. تحديا كبيرا في الإنتاج في المختبر لإدارة المحتوى في المؤسسة مناسبة لغرس أن إنتاج المحتوى بثقافة الخلية عادة ذات القوة المنخفضة نسبيا. في هذا العمل، ويرد وصف بروتوكولات لإنتاج المحتوى بالخلايا المزروعة داخل ألياف جوفاء الذبيحة غشاء السقالات. أغشية الألياف المجوفة مثقف مع خطوط الخلايا تنتجها الخلايا الليفية في وسط خلية تقليدية وحلت بعد زراعة الخلايا تسفر عن المواضيع مستمر من إدارة المحتوى في المؤسسة. الألياف الناتجة عن إدارة المحتوى في المؤسسة المنتجة بهذا الأسلوب يمكن أن يكون ديسيلولاريزيد والمجففة بالتبريد، جعلها مناسبة للتخزين وغرس.
Introduction
السقالات الجراحية القابلة للغرس تكون لاعبا أساسيا لإصلاح الجرح، مع ما يزيد على 1 مليون تنسجم البوليمر الاصطناعية مزروع في جميع أنحاء العالم كل سنة لإصلاح جدار البطن وحدها1. ومع ذلك، بعد زرع البوليمرات الاصطناعية المواد المستخدمة تقليديا في تلفيق هذه السقالات تميل إلى إثارة استجابة هيئة خارجية، أدى إلى التهاب ضارة إلى الدالة للزرع وتندب من أنسجة2 . علاوة على ذلك، كما لا يتم تشكيلها مواد مش الاصطناعية السائدة (أي، بولي بروبلين) ملحوظ من الهيئة، فتنطبق عموما على الأنسجة حيث يمكن التغاضي تندب، يحد من فائدتها السريرية تجاه المعاملة الأنسجة مع الدالة أعلى ترتيب مثل العضلات. بينما هناك العديد من المنتجات مش الجراحية التي طبقت بنجاح السريرية، الشركة المصنعة مؤخرا تشير إلى الاصطناعية الجراحية تنسجم والمضاعفات الناتجة عن عملية زرع الأنسجة فيما تبرز أهمية بلوغ الحد الأقصى لزرع توافق مع الحياة، مما دفع إدارة الأغذية والعقاقير لتشديد اللوائح المتعلقة بالعمليات الجراحية مش المصنعين3،4. غرس السقالات المستمدة من الأنسجة المرضى الخاصة يقلل من هذه الاستجابة المناعية، ولكن يمكن أن ينتج الاعتلال موقع المانحة الكبيرة5. المصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالات أنتجت في المختبر بديل ممكن، كما يحمل ديسيلولاريزيد ECM السقالات ممتازة توافق مع الحياة، لا سيما في حالة ECM ذاتي يزرع6.
بسبب محدودية توافر أنسجة المريض الحصاد لزرع ذاتي وخطر إعاقة وظيفة في موقع الجهات المانحة، القدرة على إنتاج المحتوى السقالات في المختبر من ثقافة خطوط الخلايا البشرية، أو إذا كان ذلك ممكناً، مريض الخلايا الخاصة بديل جذاب. التحديات الرئيسية في صنع كميات كبيرة من إدارة المحتوى في المؤسسة في المختبر هو عزل هذه الجزيئات صعبة الالتقاط. وقد أثبتنا في الأعمال السابقة، أن إدارة المحتوى في المؤسسة يمكن أن تنتج من استزراع الخلايا الليفية إفراز ECM في الرغاوي البوليمرية الذبيحة التي يتم حله بعد فترة الثقافة إلى ECM الغلة التي يمكن ديسيلولاريزيد لغرس7، 89،،10. كما أصدرت إدارة المحتوى في المؤسسة في الرغاوي تميل إلى اعتماد البنية الداخلية الرغاوي، استكشفت أغشية الألياف المجوفة (هفمس) سقالة الذبيحة لإنتاج مؤشرات الترابط لإدارة المحتوى في المؤسسة. المبينة في هذا التقرير أساليب مهمة لقياس معمل تصنيع أغشية الخلية ثقافة نوعية الألياف الجوفاء واستخراج الألياف المصفوفة خارج الخلية الجزء الأكبر من نفسه بعد فترة من الثقافة تنتجها الخلايا الليفية. هذا النهج ثقافة ثابتة سهولة تبني المختبرات تحتوي على معدات الثقافة خلية الثدييات القياسية. يمكن تطبيق إدارة المحتوى في المؤسسة التي تنتجها هذه النهج تجاه مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمكين العمليات الوارد وصفها إنتاج السائبة ECM الحيوية في المختبر باستخدام أغشية الألياف المجوفة يلقي بغزل رطب الجاف-جت نظام يسمح بإنتاج كميات كبيرة غير مكلفة الأغشية، فضلا عن معدات الثقافة خلية قياسية. بينما يعتزم استخدامها في خلية ثقافة الأغشية ملفقة في هذا البروتوكول، كما يمكن تكي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده البحث عنها في هذا المنشور بالمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وموسكولوسكيليتال وأمراض الجلد من “المعاهد الوطنية للصحة” تحت رقم R15AR064481، جائزة “مؤسسة العلوم الوطنية” (CMMI-1404716)، فضلا عن معهد العلوم البيولوجية ولاية أركنسو.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- . . FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. . Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).
