Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist Produktion der gesamten extrazelluläre Matrix Fasern für Wunde Reparatur gezielt die für präklinische Evaluierung im Rahmen eines Implantates, regenerative Gerüst geeignet sind. Diese Fasern hergestellt durch die Kultur der Fibroblasten auf Hohlfaser-Membranen und durch Auflösung der Membranen extrahiert.
Abstract
Veränderter Gerüste aus extrazellulären Matrix (ECM) abgeleitet haben angetriebenes erhebliches Interesse in der Medizin für ihr Potenzial in der Beschleunigung Schließung und heilende Wunde. Gewinnung von extrazellulären Matrix aus Fibrogenic Zelle Kulturen in Vitro hat Potenzial zur Erzeugung von ECM aus Menschen- und potenziell patientenspezifische Zelllinien, minimieren das Vorhandensein von xenogene Epitope, die klinische behindert hat Erfolg von einigen bestehenden ECM-Produkten. Eine große Herausforderung in der in-vitro- Produktion von ECM für eine Implantation geeignet ist, dass ECM-Produktion von Zellkultur in der Regel relativ geringe Ausbeute. In dieser Arbeit werden für die Herstellung von ECM von Zellen innerhalb Opfer Hohlfaser-Membran Gerüste kultivierten Protokolle beschrieben. Hohlfaser-Membranen sind mit Fibroblasten-Zell-Linien in einem konventionellen Zelle Medium kultiviert und aufgelöst nach Zellkultur um kontinuierliche Fäden von ECM zu erzielen. Die daraus resultierende ECM-Fasern produziert durch diese Methode können decellularized und lyophilisiert, wodurch es zur Speicherung und Implantation.
Introduction
Implantierbare chirurgische Gerüste sind fester Bestandteil der Wunde Reparatur, mit mehr als 1 Million synthetische Polymer-Netze implantiert weltweit jedes Jahr für die Bauchdecke Reparatur allein1. Jedoch nach Implantation der synthetischen Materialien Polymere traditionell bei der Herstellung von diese Gerüste verwendet tendenziell eine Fremdkörper-Reaktion, was zu Entzündungen schädlich auf die Funktion des Implantats und Vernarbung des Gewebes2 zu provozieren . Weiter, als die vorherrschende Kunststoffnetz Materialien (z.B. Polypropylen) nicht merklich vom Körper umgebaut werden, sie gelten im Allgemeinen für Gewebe wo Narbenbildung toleriert werden kann, begrenzen ihren klinischen Nutzen in der Behandlung von Gewebe mit Funktion höherer Ordnung wie Muskel. Zwar gibt es viele chirurgische Netz-Produkte, die mit klinischen Erfolg angewendet wurden, erinnert an den letzten Hersteller von synthetischen chirurgische Netze und Komplikationen von Interspezies Gewebe Implantate die Bedeutung der Maximierung der Implantat hervorheben Biokompatibilität, woraufhin die FDA Vorschriften über chirurgische anziehen mesh Hersteller3,4. Implantation von Gerüsten, abgeleitet von Patienten Gewebe reduziert diese Immunantwort, sondern kann dazu führen, dass erhebliche Entnahmestelle Morbidität5. Extrazelluläre Matrix (ECM) Gerüste produziert in Vitro sind eine mögliche Alternative, da decellularized ECM Gerüste ausgezeichnete Biokompatibilität aufweisen insbesondere bei autologen ECM6Implantate.
Wegen der begrenzten Verfügbarkeit von Patienten Gewebe für eine autologe Implantation zu ernten und das Risiko einer Funktion an der Entnahmestelle zu behindern, die Fähigkeit, ECM produzieren Gerüste in-vitro- von der Kultur des humanen Zelllinien oder, wenn möglich, ein Patient eigene Zellen ist eine attraktive Alternative. Die primären Herausforderungen bei der Herstellung von erheblichen Mengen von ECM in Vitro ist die Bindung dieser Moleküle schwierig zu erfassen. In früheren Arbeiten, haben wir bewiesen, dass ECM hergestellt werden kann, durch Kultivierung ECM-sezernierenden Fibroblasten in Opfer polymerer Schäume, die aufgelöst werden, nach der Periode der Kultur zu Ertrag ECM die decellularized kann für Implantation7, 8,9,10. Wie ECM in produziert Schäume sind in der Regel übernehmen die interne Architektur der Schäume, Hohlfaser-Membranen (HFMs) wurden als Opfer Gerüst für die Herstellung von Gewinden von ECM erkundet. Hier beschriebenen Methoden beauftragt für Labor zu skalieren, Herstellung von Zellmembranen Kultur Qualität Hohlfaser und die Gewinnung von Schüttgut extrazelluläre Matrix Fasern aus gleich nach einer Periode des Fibroblasten-Kultur. Dieser statische Kultur Ansatz ist von Labors mit standard Säugerzelle Kultur Ausrüstung leicht annehmbar. ECM, produziert durch diese Vorgehensweise konnte gegenüber einer Vielzahl von klinischen Anwendungen angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebenen Prozesse ermöglichen die Produktion von Bulk ECM Biomaterialien in Vitro mit Hohlfaser-Membranen von einem trocken-Jet nass Spinnerei System für kostengünstige Massenproduktion der Membranen sowie Standardzelle Kultur Ausrüstung geworfen. Während die Membranen, die in diesem Protokoll hergestellt für den Einsatz in der Zellkultur bestimmt sind, kann das beschriebene System auch für die Herstellung von Membranen zur Trennung Zwecke mit Pore Verteilung und hohle Faser Größendimensionen a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung berichtet in dieser Publikation wurde unterstützt vom National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett und Hauterkrankungen von den National Institutes of Health unter Prämiennummer R15AR064481, der National Science Foundation (CMMI-1404716), sowie die Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
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