Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è la produzione delle fibre di intera tabella extracellulare mirati per la riparazione della ferita che sono adatti per la valutazione preclinica come parte di un impianto di impalcatura rigenerativa. Queste fibre sono prodotte dalla cultura dei fibroblasti su membrane a fibra cava ed estratte dalla dissoluzione delle membrane.
Abstract
Scaffold ingegnerizzati derivato dalla matrice extracellulare (ECM) hanno guidato significativo interesse in medicina per il loro potenziale nel velocizzare ferita la chiusura e la guarigione. Estrazione della matrice extracellulare da fibrogenica cell culture in vitro ha il potenziale per la generazione di ECM da linee cellulari umane – e potenzialmente paziente-specifici, riducendo al minimo la presenza di epitopi xenogeniche che ha ostacolato la clinica successo di alcuni prodotti ECM esistenti. Una sfida significativa nella produzione in vitro di ECM adatto per l’impianto è che la produzione di ECM mediante coltura cellulare è in genere di rendimento relativamente basso. In questo lavoro vengono descritti i protocolli per la produzione di ECM dalle cellule coltivate all’interno di impalcature di membrana a fibra cava sacrificale. Membrane a fibra cava sono coltivate con linee cellulari di fibroblasti in un mezzo di cella convenzionale e dissolto dopo coltura cellulare per produrre fili continui di ECM. Le fibre risultanti ECM prodotte da questo metodo possono essere decellularized e liofilizzate, rendendolo adatto per lo stoccaggio e l’impianto.
Introduction
Ponteggi chirurgici impiantabili sono un appuntamento fisso della riparazione della ferita, con oltre 1 milione polimero sintetico mesh impiantata in tutto il mondo ogni anno per la riparazione della parete addominale da solo1. Tuttavia, a seguito dell’impianto i polimeri sintetici materiali tradizionalmente utilizzati nella fabbricazione di queste impalcature tendono a provocare una reazione da corpo estraneo, con conseguente infiammazione deleterio per la funzione dell’impianto e cicatrizzazione del tessuto2 . Inoltre, come i materiali predominanti mesh sintetico (cioè, polipropilene) non sono sensibilmente ristrutturati dal corpo, essi sono generalmente applicabile ai tessuti dove può essere tollerata la cicatrizzazione, limitando la loro utilità clinica verso il trattamento di tessuti con funzione di ordine superiore quale il muscolo. Mentre ci sono molti prodotti di maglia chirurgica che sono stati applicati con successo clinico, produttore risale ricorda sintetica chirurgico maglie e complicazioni dagli innesti di tessuto interspecie evidenziano l’importanza di ottimizzazione dell’impianto biocompatibilità, spingendo la FDA per stringere i regolamenti sulla chirurgica maglia produttore3,4. L’impianto di scaffold derivate dai tessuti dei pazienti riduce la risposta immunitaria, ma può provocare significative del donatore-luogo morbosità5. Matrice extracellulare (ECM) impalcature prodotte in vitro sono una possibile alternativa, come decellularizzati ECM ponteggi esibiscono eccellente biocompatibilità, particolarmente nel caso di trapianto autologo ECM impianti6.
A causa della limitata disponibilità di tessuto del paziente per la raccolta per l’impianto autologo ed il rischio di ostacolare la funzione al luogo erogatore, la capacità di produrre ECM ponteggi in vitro dalla coltura di linee cellulari umane o, se possibile, di un paziente possedere le cellule è un’alternativa attraente. Le sfide principali nella produzione di notevoli quantità di ECM in vitro è il sequestro di queste molecole di difficile acquisizione. Nel precedente lavoro, abbiamo dimostrato che ECM può essere prodotta coltivando fibroblasti ECM-secernente in schiume polimeriche sacrificale che sono dissolti dopo il periodo di coltura di ECM di rendimento che può essere decellularized per l’impianto7, 8,9,10. Come ECM prodotta schiume tendono ad adottare l’architettura interna delle schiume, membrane a fibra cava (HFMs) sono state esplorate come impalcatura sacrificale per la produzione di fili di ECM. Descritto nel presente documento sono metodi compiti per laboratorio scala produzione di membrane a fibra cava qualità cultura delle cellule e l’estrazione delle fibre della matrice extracellulare di massa dallo stesso dopo un periodo di coltura del fibroblasto. Questo approccio di coltura statica è facilmente adottabile da laboratori contenenti attrezzature per cultura standard su cellule di mammifero. ECM prodotto da questo approccio potrebbe essere applicato verso una varietà di applicazioni cliniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
I processi descritti consentono la produzione di massa ECM biomateriali in vitro utilizzando membrane a fibra cava espressi da un sistema a secco-jet wet spinning permettendo per produzione all’ingrosso poco costoso di membrane, nonché attrezzature di cultura cellulare standard. Mentre le membrane fabbricate in questo protocollo sono destinate per l’uso nella coltura delle cellule, il sistema descritto può anche essere adattato per la produzione di membrane per scopi di separazione, con poro distribuzione e ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall’Istituto nazionale dell’artrite e patologie del sistema muscoloscheletrico e malattie della pelle dei National Institutes of Health, sotto numero di premio R15AR064481, la National Science Foundation (CMMI-1404716), nonché la Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
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