बलि खोखले फाइबर झिल्ली सेल संस्कृति के माध्यम से Extracellular मैट्रिक्स फाइबर का उत्पादन
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य पूरे extracellular मैट्रिक्स घाव की मरंमत जो एक अपक्षयी पाड़ प्रत्यारोपण के भाग के रूप में नैदानिक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है के लिए लक्षित फाइबर का उत्पादन होता है । इन तंतुओं खोखले फाइबर झिल्ली पर fibroblasts की संस्कृति द्वारा उत्पादित कर रहे है और झिल्ली के विघटन के द्वारा निकाले ।
Abstract
extracellular मैट्रिक्स (ECM) से व्युत्पंन इंजीनियर पाड़ तेजी लाना घाव बंद करने और उपचार में अपनी क्षमता के लिए चिकित्सा में महत्वपूर्ण रुचि प्रेरित किया है । इन विट्रो में fibrogenic सेल संस्कृतियों से extracellular मैट्रिक्स के निष्कर्षण मानव से ECM की पीढ़ी के लिए क्षमता है और संभावित रोगी-विशिष्ट सेल लाइनों, xenogeneic epitopes की उपस्थिति जो नैदानिक बाधा है ंयूनतम कुछ मौजूदा ECM उत्पादों की सफलता । में एक महत्वपूर्ण चुनौती ECM के इन विट्रो उत्पादन आरोपण के लिए उपयुक्त है कि सेल संस्कृति द्वारा ECM उत्पादन आमतौर पर अपेक्षाकृत कम उपज है । इस काम में, प्रोटोकॉल ECM के उत्पादन के लिए वर्णन कर रहे है प्रसंस्कृत कोशिकाओं द्वारा बलि खोखले फाइबर झिल्ली पाड़ के भीतर । खोखले फाइबर झिल्ली एक पारंपरिक कोशिका माध्यम में fibroblast सेल लाइनों के साथ संस्कृति और कोशिका संस्कृति के बाद भंग ECM के निरंतर धागे उपज रहे हैं । परिणामस्वरूप ECM इस विधि द्वारा उत्पादित तंतुओं और lyophilized जा सकता है, यह भंडारण और आरोपण के लिए उपयुक्त प्रतिपादन ।
Introduction
प्रत्यारोपित शल्य पाड़ों घाव की मरंमत के एक दृढ़ रहे हैं, के साथ १,०००,००० से अधिक सिंथेटिक बहुलक अकेले पेट की दीवार की मरंमत1के लिए दुनिया भर में प्रत्यारोपित जाल । हालांकि, आरोपण सिंथेटिक सामग्री पारंपरिक रूप से इन पाड़ों के निर्माण में इस्तेमाल किया पॉलिमर के लिए एक विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया को भड़काने के लिए करते हैं, प्रत्यारोपण और 2 ऊतक के scarring के समारोह के लिए सूजन बचके में जिसके परिणामस्वरूप . इसके अलावा, प्रमुख सिंथेटिक मेष सामग्री (यानी, के रूप में) appreciably शरीर द्वारा remodeled नहीं कर रहे हैं, वे आम तौर पर जहां scarring सहन किया जा सकता है ऊतकों को लागू कर रहे हैं, के उपचार की ओर उनके नैदानिक उपयोगिता सीमित उच्च आदेश के साथ ऊतकों ऐसे मांसपेशी के रूप में समारोह । हालांकि नैदानिक सफलता के साथ लागू किया गया है, जो कई सर्जिकल मेष उत्पादों रहे हैं, हाल के निर्माता सिंथेटिक सर्जिकल जाल की याद करते हैं और एक से अधिक प्रजातियों के ऊतकों प्रत्यारोपण से जटिलताओं को बढ़ाने के महत्व को उजागर , सर्जिकल मेष निर्माताओं3,4पर नियमों को कसने के लिए एफडीए शीघ्र रोगियों के अपने ऊतकों से व्युत्पंन पाड़ के आरोपण इस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कम कर देता है, लेकिन महत्वपूर्ण दाता-साइट रुग्णता5में परिणाम कर सकते हैं । Extracellular मैट्रिक्स (ECM) इन विट्रो में उत्पादित पाड़ों एक संभव विकल्प हैं, के रूप में विसेलुलर ECM पाड़ों विशेष रूप से ऑटोलॉगस ECM प्रत्यारोपण6के मामले में उत्कृष्ट असंगति प्रदर्शन, ।
रोगी ऊतक की सीमित उपलब्धता के कारण ऑटोलॉगस आरोपण के लिए फसल के लिए और दाता साइट पर समारोह में बाधा का खतरा, मानव कोशिका लाइनों की संस्कृति से इन विट्रो में ECM पाड़ों का उत्पादन करने की क्षमता या, यदि संभव हो तो, एक मरीज की खुद की कोशिकाओं को एक आकर्षक विकल्प है । इन विट्रो में ECM की पर्याप्त मात्रा के निर्माण में प्राथमिक चुनौतियों इन मुश्किल से कब्जा अणुओं की ज़ब्ती है. पिछले काम में, हम ने दिखा दिया है कि ECM संवर्धन ECM-बलि बहुलक फोम कि संस्कृति अवधि के बाद भंग कर रहे है उपज के लिए ECM जो आरोपण7के लिए विघटित किया जा सकता है में स्रावित fibroblasts द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, 8,9,10. के रूप में फोम में उत्पादित ECM फोम के आंतरिक वास्तुकला को अपनाने के लिए करते हैं, खोखले फाइबर झिल्ली (HFMs) ECM के धागे के उत्पादन के लिए एक बलि पाड़ के रूप में पता लगाया गया । यहां वर्णित तरीके सेल संस्कृति गुणवत्ता खोखले फाइबर झिल्ली और fibroblast संस्कृति की एक अवधि के बाद एक ही से थोक extracellular मैट्रिक्स फाइबर के निष्कर्षण के प्रयोगशाला पैमाने पर निर्माण के लिए काम कर रहे हैं । यह स्थिर संस्कृति दृष्टिकोण मानक स्तनधारी सेल संस्कृति उपकरणों युक्त प्रयोगशालाओं द्वारा आसानी से अपनाने है । ECM इस दृष्टिकोण द्वारा उत्पादित नैदानिक अनुप्रयोगों की एक किस्म की ओर लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रक्रियाओं में थोक ECM के उत्पादन को सक्षम वर्णित इन विट्रो खोखले फाइबर झिल्ली का उपयोग कर एक सूखी-जेट गीला कताई प्रणाली झिल्ली की सस्ती थोक उत्पादन के लिए अनुमति के रूप में अच्छी तरह से मानक सेल संस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुसंधान के इस प्रकाशन में सूचना दी राष्ट्रीय गठिया और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस और त्वचा रोगों के राष्ट्रीय संस्थान पुरस्कार संख्या R15AR064481, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (CMMI-१४०४७१६) के तहत, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Arkansas विज्ञान संस्थान ।
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
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