Производство волокон внеклеточного матрикса через жертвенную полые волокна мембраны клеточной культуры
Summary
Целью настоящего Протокола является производство всего внеклеточная матрица волокон, предназначенных для ремонта раны, которые подходят для доклинических оценки как часть имплантата регенеративной эшафот. Эти волокна производятся культуры фибробластов на полые волокна мембраны и извлекается путем растворения мембран.
Abstract
Инженерии подмостей, производный от внеклеточного матрикса (ECM) имеют управляемый значительный интерес в медицине для их потенциал в деле ускорения закрытия и исцеления. Извлечение внеклеточного матрикса из Фиброгенные клеток культур в vitro имеет потенциал для поколения ECM от человека – и потенциально пациент конкретных клеточных линий, сведение к минимуму присутствие культивированная epitopes, которая препятствовала клинических успех некоторых существующих продуктов ECM. Серьезной проблемой в vitro производства ЭВМ для имплантации является производство ECM на культуры клеток обычно относительно низкой доходности. В этой работе описываются протоколы для производства ECM клетки культивировали в жертвенных полые волокна мембраны строительные леса. Полые волокна мембраны культивируемых с линии клетки фибробластов в среде обычных ячеек и распущен после культуры клеток для получения непрерывной нити ECM. Результате ECM волокон, производимых этим методом может быть decellularized и лиофилизованный, делает его подходящим для хранения и имплантации.
Introduction
Имплантируемые хирургические подмостей являются арматуре ремонта раны, с более чем одного миллиона синтетических полимерных сеток имплантированы во всем мире каждый год для брюшной стенки ремонт только1. Однако после имплантации Полимеры синтетические материалы традиционно используемые в производстве этих лесов стремятся спровоцировать ответ инородного тела, что приводит к воспаление пагубные функции имплантата и рубцов ткани2 . Кроме того, как преобладающим синтетические сетки материалов (то есть, полипропилен) не являются в значительной степени перестроенный органом, они обычно применимы к ткани, где рубцы могут быть терпимы, ограничивая их клинической полезности к лечения ткани с функции высокого порядка, таких как мышцы. Хотя есть много Хирургическая сетка продуктов, которые были применены с клинический успех, последние производитель вспоминает Хирургические синтетические сетки и осложнений в результате межвидовой ткани имплантатов подчеркнуть важность максимального использования имплантата биосовместимость, вызвав FDA ужесточить правила на хирургические сетка производителей3,4. Имплантация подмостей, полученных от пациентов собственных тканей уменьшает этот иммунный ответ, но может привести к значительным доноров сайт заболеваемости5. Внеклеточная матрица (ECM) подмостей производится в vitro . Возможная альтернатива, как decellularized ECM подмостей экспонат отличная биосовместимость, особенно в случае аутологичной ECM имплантатов6
Из-за ограниченной доступности пациента ткани урожай аутологичной имплантации и риск противодействия функция на сайте доноров, способность производить ECM лесов в vitro от культуры линий клеток человека или, если возможно, пациента собственные клетки является привлекательной альтернативой. Основные проблемы в производстве значительное количество ECM в пробирке является поглощение этих трудных для захвата молекул. В предыдущей работе, мы продемонстрировали, что ЕСМ могут быть произведены путем культивирования ECM-секретирующих фибробластов в жертвенных полимерные пены, которые растворяются после периода культуры ECM доходность, которая может быть decellularized для имплантации7, 8,9,10. ECM производится в пены склонны принять внутреннюю архитектуру пены, полые волокна мембраны (HFMs) были изучены как жертвенное леска для изготовления нитей ECM. Описанные здесь методы задают для лаборатории масштабирования, изготовление полых волокон мембран клеток культуры качества и извлечения сыпучих внеклеточная матрица волокон из того же после периода культуры фибробластов. Этот статический культуры подход легко Даримые лабораториями, содержащий стандартные mammalian клетки культуры оборудования. ECM, производимые этот подход может быть применен к различных клинических приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описаны процессы позволяют производства массовых ECM биоматериалов в пробирке с помощью полых волокон оболочек поданных система сухой Джет мокрого прядения позволяет для производства недорогих массовых мембраны, а также стандартная ячейка культуры оборудования. Хотя мембраны из…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в этой публикации была поддержана национального института артрита и Musculoskeletal и кожных заболеваний национального института здравоохранения под номером премии R15AR064481, Национальный научный фонд (CMMI-1404716), а также Институт бионауки Арканзас.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- . . FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. . Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).
