JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

Nanoemulsione Tripeptide-stabilizzato di acido oleico

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59034
, , , ,
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network

Summary

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per sintetizzare una Nanoemulsione di un coniugato acido oleico acids-platinum(II) stabilizzato con un tripeptide di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Le forme di Nanoemulsione in condizioni blande sintetiche tramite auto-assemblaggio del KYF e il coniugato.

Abstract

Descriviamo un metodo per produrre una Nanoemulsione composto da un nucleo di acids-Pt(II) acido oleico e un rivestimento (KYF) di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE incapsula PT al 10% in peso, ha un diametro di 107 ± 27 nm e una carica negativa di superficie. KYF-Pt-NE è stabile in acqua e in siero ed è biologicamente attivo. La coniugazione di un fluoroforo di KYF permette la sintesi di una Nanoemulsione fluorescente che è adatto per l’imaging biologico. La sintesi del Nanoemulsione viene eseguita in un ambiente acquoso e le forme di KYF-Pt-NE via auto-assemblaggio di un peptide KYF breve e un coniugato acido oleico acids-platinum(II). L’auto-assemblaggio processo dipende la temperatura della soluzione, il rapporto molare dei substrati e la portata dell’aggiunta del substrato. Passi fondamentali includono mantenendo il tasso ottimale di agitazione durante la sintesi, permettendo un tempo sufficiente per l’auto-assemblaggio e pre-concentrando la Nanoemulsione gradualmente in un concentratore centrifugo.

Introduction

Negli ultimi anni, c’è stato un crescente interesse nell’ingegneria di nanoparticelle per applicazioni biomedicali come consegna della droga e bioimmagini1,2,3,4. La multifunzionalità dei sistemi basati su nanoparticelle richiede spesso incorporando più componenti all’interno di una formulazione. I mattoni che si basano sui lipidi o polimeri spesso differiscono in termini di loro proprietà fisico-chimiche nonché loro biocompatibilità e biodegradabilità, che alla fine potrebbe influenzare la funzione della nanostruttura1, 5,6. Materiali biologicamente derivate, quali proteine e peptidi, hanno da tempo riconosciute come promettente componenti di nanostrutture multifunzionale a causa della loro sequenza flessibilità7,8. Peptidi assemblarsi in architetture supramolecolari altamente ordinate formando elicoidale nastri9,10, impalcature fibroso11,12e molti altri, aprendo così la strada alla costruzione nanostrutture ibride basate su biomolecole utilizzando un ascendente approccio13.

Peptidi sono stati esplorati per applicazioni in medicina e biotecnologia, soprattutto per la terapia anticancro14 e malattie cardiovascolari15 anche per quanto riguarda lo sviluppo antibiotico16,17, metabolica disturbi18e infezioni19. Ci sono oltre un centinaio di piccole-peptide terapeutica in fase di test clinici20. Peptidi sono facili da modificare e veloce di sintetizzare a basso costo. Inoltre, sono biodegradabili, che facilita notevolmente il loro applicazioni biologiche e farmaceutiche21,22. L’utilizzo di peptidi come componenti strutturali comprende l’ingegneria di nanoparticelle reattive, peptidici e idrogel depositi per rilascio controllato23,24,25,26 , 27, biosensori peptidici28,29,30,31o dispositivi bio-elettroniche32,33,34. Cosa importante, sono stati trovati anche brevi peptidi con due o tre residui dell’amminoacido che includono fenilalanina per guidare l’auto-assemblaggio elabora35,36,37 e creare emulsioni stabilizzate38 .

Farmaci a base di platino, a causa della loro alta efficacia, sono utilizzati in molti regimi di trattamento del cancro, sia da solo che in combinazione con altri agenti39,40. Composti del platino inducono danni al DNA formando legami incrociati monoadducts e intrastrand o interstrand. Le lesioni di Pt-DNA sono riconosciute dal macchinario cellulare e, se non riparato, portano all’apoptosi cellulare. Il meccanismo più importante, che contribuisce alla morte della cellula tumorale, PT è l’inibizione della trascrizione del DNA41,42. Tuttavia, i benefici della terapia di platino sono diminuiti di tossicità sistemica di PT che provoca gravi effetti collaterali. Questo porta a più basso dosaggio clinica di PT43, che si traduce spesso in concentrazioni sub-terapeutiche di platino raggiungendo il DNA. Di conseguenza, la riparazione del DNA che segue contribuisce alla sopravvivenza della cellula tumorale e l’acquisizione di resistenza Pt. La chemio-resistenza del platino è un problema importante nella terapia anticancro e la causa principale del trattamento fallimento44,45.

Abbiamo sviluppato una stabile irraggiungibili che incapsula l’agente PT al fine di fornire un effetto di schermatura nella circolazione sistemica e per diminuire gli effetti collaterali indotti da Pt II. Il sistema si basa su un nucleo di acido oleico acids-Pt(II) stabilizzato con un tripeptide KYF per formare una Nanoemulsione (KYF-Pt-NE)46. Gli elementi costitutivi di KYF-Pt-NE, gli aminoacidi del tripeptide, come pure l’acido oleico, hanno lo status di generalmente riconosciuti come sicuri (GRAS) con la Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE viene preparato utilizzando un metodo di nanoprecipitazione47. In breve, il coniugato acids-Pt(II) oleico è disciolto in un solvente organico e quindi aggiunto goccia a goccia di una soluzione acquosa di KYF (Figura 1) a 37 ° C. La soluzione è agitata per diverse ore consentire l’auto-assemblaggio di KYF-Pt-NE. La Nanoemulsione è concentrata in 10 kDa concentratori centrifughi e lavati tre volte con acqua. La modificazione chimica di KYF con un fluoroforo permette la sintesi di fluorescente FITC-KYF-Pt-NE adatto per imaging biomedico.

Protocol

1. sintesi del coniugato acido oleico Acids–Platinum(II) Attivazione di cisplatino Sospendere 50 mg (0.167 mmol) di cisplatino in 4 mL di acqua (ad es., nanopure) a 60 ° C. Aggiungere goccia a goccia 55,2 mg (0.325 mmol) di AgNO3 in 0,5 mL di acqua per la soluzione di cisplatino e mescolare la reazione per almeno 2 h a 60 ° C. Il precipitato bianco di AgCl formerà che indica l’avanzamento della reazione. Per determinare se la reazione di attivazione è stata complet…

Representative Results

Immagine rappresentante TEM di KYF-Pt-NE preparato usando questo protocollo è mostrato nella Figura 2A. KYF-Pt-NEs sono sferici in morfologia, ben dispersero e di dimensioni uniformi. Il diametro del nucleo di KYF-Pt-NEs, misurata direttamente da tre immagini TEM con un minimo di 200 misure effettuate, è 107 ± 27 nm. Il diametro idrodinamico di KYF-Pt-NE, analizzato usando la spettroscopia luce dinamica (DLS), è stato trovato per essere 240 nm con un indi…

Discussion

Fasi critiche nella sintesi Nanoemulsione includono il rapporto molare dei substrati di regolazione, mantenendo il controllo di tasso di flusso e temperatura durante l’aggiunta di acido oleico acids–Pt(II), fornire tempo sufficiente per l’auto-assemblaggio e purificare il prodotto utilizzando un colonna di concentratore centrifugo. Questi parametri influenzano le dimensioni e la morfologia di KYF-Pt-NE; Pertanto, è particolarmente importante mantenere il corretto rapporto molare e regolare correttamente le condizioni …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario dal National Cancer Institute, concedere SC2CA206194. Concorrenti interessi finanziari non vengono dichiarati.

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based ‘on-off’ biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). 암 연구학. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas, ., J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. . Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User’s Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

Keywords: TripeptideNanoemulsionOleic AcidCisplatinPlatinumOvarian CancerPeptide ModificationDiagnosticPharmaceuticalIn-vivo StudiesFmocL-phenylalanineL-tyrosineTBTUDIPEA
check_url/kr/59034?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image