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Abstract
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생체공학

Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59034
, , , ,
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network

Summary

Este protocolo describe un método eficiente para sintetizar una nanoemulsión de un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II) estabilizado con un tripéptido de lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Las formas de nanoemulsión condiciones suaves sintético a través de autoensamblaje de lo KYF y el conjugado.

Abstract

Se describe un método para producir una nanoemulsión compuesto de un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) y una capa de (KYF) de fenilalanina-tirosina-lisina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) en 10% en peso, tiene un diámetro de 107 ± 27 nm y una carga superficial negativa. KYF-Pt-NE es estable en agua y suero y es biológicamente activo. La conjugación de un fluoróforo a KYF permite la síntesis de una nanoemulsión fluorescente adecuado para la proyección de imagen biológica. La síntesis de la nanoemulsión se realiza en un ambiente acuoso y las formas de KYF-Pt-NE a través de uno mismo-montaje de un péptido corto de KYF y un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II). El proceso uno mismo-Asamblea depende de la temperatura de la solución, la fracción molar de los sustratos y la tasa de flujo de la adición del sustrato. Pasos cruciales incluyen mantener el ritmo óptimo de agitación durante la síntesis, permitiendo suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y la concentración la nanoemulsión gradualmente en un concentrador centrífugo.

Introduction

En los últimos años ha habido un creciente interés en la ingeniería de nanopartículas para aplicaciones biomédicas como la entrega de la droga y Bioimagen1,2,3,4. La multifuncionalidad de los sistemas basados en nanopartículas requiere a menudo incorporando múltiples componentes dentro de una formulación. Los bloques que se basan en lípidos o polímeros a menudo difieren en cuanto a sus propiedades fisicoquímicas así como su biocompatibilidad y biodegradabilidad, que podría afectar la función de la nanoestructura1, 5,6. Materiales derivados biológicamente, tales como proteínas y péptidos, durante mucho tiempo han sido reconocidos como componentes prometedores de nanoestructuras multifuncionales debido a su flexibilidad de secuencia7,8. Péptidos, uno mismo-montar en arquitecturas supramoleculares altamente ordenadas formación helicoidal cintas9,10, andamios fibroso11,12y muchos más, allanando así el camino para la construcción Nanoestructuras basados en biomoléculas híbrido utilizando un fondo enfoque13.

Péptidos se han explorado para aplicaciones en medicina y biotecnología, especialmente para la terapia contra el cáncer14 y enfermedades cardiovasculares15 así como en cuanto a desarrollo de antibiótico16,17, metabólicos trastornos18y19de las infecciones. Hay más de un centenar de pequeños péptidos terapéuticos sometidos a ensayos clínicos20. Péptidos son fáciles de modificar y a sintetizar a bajo costo. Además, son biodegradables, que facilita sus aplicaciones biológicas y farmacéuticas21,22. El uso de péptidos como componentes estructurales incluye la ingeniería de nanopartículas basada en péptidos, sensibles y depósitos de hidrogel para liberación controlada23,24,25,26 , 27, biosensores basados en péptidos28,29,30,31o dispositivos bio-electrónicos32,33,34. Lo importante, se encontraron péptidos cortos incluso con dos o tres residuos de aminoácidos que incluyen fenilalanina para guiar a la uno mismo-Asamblea35,36,37 los procesos y crear emulsiones estabilizadas38 .

Fármacos basados en platino, debido a su alta eficacia, se utilizan en muchos regimenes de tratamiento del cáncer, tanto solos como en combinación con otros agentes39,40. Compuestos de platino inducen daño en el ADN por formación de enlaces cruzados de monoadducts e intrafilamentoso o interstrand. Las lesiones de Pt-ADN son reconocidas por la maquinaria celular y, si no se repara, conducen a la apoptosis celular. El mecanismo más importante, por que Pt(II) contribuye a la muerte de la célula de cáncer, es la inhibición de DNA transcripción41,42. Sin embargo, los beneficios de la terapia de platino son disminuidos por la toxicidad sistémica de Pt(II) que provoca efectos secundarios graves. Esto conduce a baja dosificación clínicos de Pt(II)43, que a menudo resulta en concentraciones subterapéuticas de platino alcanzando el ADN. Como consecuencia, la reparación del ADN que sigue contribuye a la supervivencia de la célula de cáncer y adquisición de resistencia de Pt(II). La quimio-resistencia del platino es un problema importante en la terapia contra el cáncer y la principal causa de fracaso de tratamiento44,45.

Hemos desarrollado un estable nanosistemas que encapsula al agente Pt(II) para proporcionar un efecto protector en la circulación sistémica y a disminuir los efectos secundarios inducidos por el Pt II. El sistema se basa en un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) estabilizado con un tripéptido KYF para formar una nanoemulsión (KYF-Pt-NE)46. Los bloques de edificio de KYF-Pt-NE, los aminoácidos de la tripéptido así como el ácido oleico, poseen el estado generalmente reconocido como seguro (GRAS) con alimentos y drogas (FDA). KYF-Pt-NE se prepara utilizando un método de nanoprecipitation47. En Resumen, el acids-Pt(II) oleico conjugado es disuelto en un solvente orgánico y luego se agrega gota a gota a una solución acuosa de KYF (figura 1) a 37 ° C. La solución se agita durante varias horas permitir que uno mismo-Asamblea de KYF-Pt-ne La nanoemulsión está concentrada en concentradores centrífugos de 10 kDa y lavaron tres veces con agua. La modificación química de KYF con un fluoróforo permite la síntesis de FITC-KYF-Pt-NE fluorescente adecuado para la proyección de imagen biomédica.

Protocol

1. síntesis del Acids–Platinum(II) ácido oleico conjugado Activación de cisplatino Suspender (0.167 mmol) de 50 mg de cisplatino, en 4 mL de agua (por ejemplo, nanopure) a 60 ° C. Añadir gota a gota 55,2 mg (0.325 mmol) de AgNO3 en 0,5 mL de agua a la solución de cisplatino y revuelva la reacción durante al menos 2 h a 60 ° C. El precipitado blanco de AgCl forma indicando el progreso de la reacción. Para determinar si la reacción de activación se ha completa…

Representative Results

Imagen de TEM representante de KYF-Pt-NE preparado mediante este protocolo se muestra en la figura 2A. KYF-Pt-NEs son esféricos en morfología, bien dispersa y uniforme en tamaño. El diámetro del núcleo de KYF-Pt-NEs, medido directamente en tres imágenes TEM con un mínimo de 200 medidas hecho, es 107 ± 27 nm. Diámetro hidrodinámico de KYF-Pt-NE, analizada mediante espectroscopia de luz dinámica (DLS), fue encontrado para ser 240 nm con un índice de…

Discussion

Pasos críticos en la síntesis de nanoemulsión incluyen ajustar la relación molar de los substratos, mantener la temperatura y el flujo de control de la frecuencia durante acids–Pt(II) oleico además, proporcionando suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y purificar el producto usando un columna del concentrador centrífugo. Estos parámetros influyen en el tamaño y la morfología de KYF-Pt-NE; por lo tanto, es particularmente importante mantener la relación molar apropiada y ajustar correctamente las condicion…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos el apoyo financiero del Instituto Nacional del cáncer, concesión de SC2CA206194. No se declaran intereses financieros que compiten.

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring
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Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).
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