Этот протокол описывает эффективный метод синтеза nanoemulsion олеиновая acids-platinum(II) конъюгата, стабилизировалось с трипептид лизин тирозин фенилаланин (KYF). Nanoemulsion формы умеренный синтетических условиях через самостоятельной сборки KYF и сопряженное.
Мы опишем способ получения nanoemulsion, состоящий из олеиновая acids-Pt(II) ядро и покрытие лизин тирозин фенилаланин (KYF) (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE инкапсулирует Pt(II) на 10% веса, имеет диаметр 107 Нм ± 27 и отрицательный заряд поверхности. KYF-Pt-NE стабилен в воде и в сыворотке крови и биологически активен. Спряжение Флюорофор к KYF позволяет синтеза люминесцентных nanoemulsion, которая подходит для биологической обработки изображений. Синтез nanoemulsion проводится в водной среде и KYF-Pt-NE форм через самосборки коротких пептида KYF и олеиновая acids-platinum(II) конъюгата. Самостоятельной сборки процесс зависит от температуры раствора, молярное соотношение субстратов и скорость потока добавления субстрата. Важнейшие шаги включают поддержание оптимальной скорости перемешивания во время синтеза, разрешительные достаточное время для самостоятельной сборки и предварительно сконцентрировав nanoemulsion постепенно в центробежных концентратор.
В последние годы наблюдается растущий интерес к инженерии наночастицы для таких биомедицинских приложений как поставки наркотиков и bioimaging1,2,3,4. Многофункциональность систем на основе наночастиц часто обусловливает необходимость включения нескольких компонентов в рамках одной разработке. Строительные блоки, которые часто основаны на липиды или полимеры отличаются с точки зрения их физико-химических свойств, а также их биосовместимости и способность к биологическому разложению, которое в конечном итоге может повлиять на функции наноструктурированных1, 5,6. Биоселективного материалы, такие как белки и пептиды, давно были признаны перспективным компоненты многофункциональных наноструктур из-за их гибкость последовательности7,8. Пептиды, самостоятельно собрать в весьма упорядоченный супрамолекулярные архитектуры, образуя цилиндрические лентами9,10, волокнистых подмостей11,12и многие другие, проложив тем самым путь к зданию снизу вверх наноструктур на основе биомолекулы гибридный подход к13.
Пептиды были изучены для приложений в области медицины и биотехнологии, особенно для противоопухолевой терапии14 и сердечно-сосудистых заболеваний15 а что касается антибиотик развития16,17, метаболический расстройства18и инфекции19. Существует более сотни малых пептид терапевтов проходят клинические испытания20. Пептиды легко изменить и быстро, чтобы синтезировать при низких затратах. Кроме того они являются биологически, что значительно облегчает их биологических и фармацевтических приложения21,22. Использование пептидов как структурных компонентов включает в себя техники реагировать, на основе пептида наночастиц и складов Гидрогель для контролируемого высвобождения23,24,25,26 , 27, биосенсоры на основе пептида28,,2930,31или био электронных устройств32,,3334. Важно отметить, что даже короткие пептиды с двумя или тремя аминокислотных остатков, которые включают фенилаланина были найдены для самостоятельной сборки процессов35,,3637 и создавать стабилизированные эмульсии38 .
Препараты на основе платины, ввиду их высокой эффективности, используются в многих схем лечения рака, как самостоятельно, так и в сочетании с другими агентами39,40. Платиновый соединений вызвать повреждение ДНК, образуя monoadducts и intrastrand или interstrand перекрестные ссылки. Pt-ДНК поражения распознаются клеточными и, если не отремонтированы, привести к сотовой апоптоз. Наиболее важный механизм, по которому Pt(II) способствует гибели клеток рака, является ингибирование транскрипции ДНК41,42. Однако преимущества платиновой терапии уменьшаются по системной токсичности Pt(II), что вызывает серьезные побочные эффекты. Это приводит к нижней клинических дозирование Pt(II)43, которая часто приводит к югу терапевтические концентрации платины, достигнув ДНК. Как следствие репарации ДНК, который следует способствует выживание клетки рака и приобретения Pt(II) сопротивления. Платиновый химио сопротивление является серьезной проблемой в противоопухолевой терапии и основной причиной неудачи лечения44,45.
Мы разработали стабильной наносистем, инкапсулирующий агент Pt(II) для того чтобы обеспечить защитный эффект в кровообращения и уменьшить побочные эффекты Pt II-индуцированной. Система основана на ядре олеиновая acids-Pt(II) стабилизированы с KYF трипептид сформировать nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Строительные блоки KYF-Pt-NE, аминокислоты, трипептид, так и олеиновой кислоты, имеют статус обычно признается как безопасное (GRAS) с продуктами питания и лекарствами (FDA). KYF-Pt-NE готовится с помощью метода nanoprecipitation47. Короче говоря олеиновая acids-Pt(II) конъюгата растворяется в органических растворителях и затем добавлены каплям водный раствор KYF (рис. 1) при 37 ° C. Раствор перемешивали за несколько часов, чтобы позволить самостоятельной сборки из KYF-Pt-NE. Nanoemulsion в основном в 10 кДа Центробежные концентраторы и три раза промывают водой. Химическая модификация KYF с Флюорофор позволяет синтеза люминесцентных FITC-KYF-Pt-NE для биомедицинских изображений.
Важнейшие шаги в синтезе nanoemulsion включают корректировки молярное соотношение субстратов, контроль температуры и потока скорость во время добавления олеиновая acids–Pt(II), предоставляя достаточное время для самостоятельной сборки и очистки продукта с помощью Центробежный концентратор с?…
The authors have nothing to disclose.
Мы с благодарностью признаем финансовой поддержке Национального института рака, Грант SC2CA206194. Объявляются не конкурирующих финансовых интересов.
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |