Isolation og adoptiv overførsel af højt saltindhold behandlet Antigen-præsenterer dendritiske celler

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at isolere dendritiske celler fra murine milt af magnetiske celle sortering og efterfølgende adoptiv overførsel til naive mus. Model af høj-salt aktiveret dendritiske celler blev valgt til at forklare de trinvise procedurer adoptiv overførsel og flowcytometri.

Abstract

Overskydende salt indtagelse bidrager til inflammation og spiller en afgørende rolle i udviklingen af hypertension. Vi har tidligere fundet at antigen-præsenterer dendritiske celler (DCs) kan fornemme forhøjede ekstracellulært natrium fører til aktivering af NADPH oxidase og dannelsen af isolevuglandin (IsoLG)-protein adukter. Disse IsoLG-protein adukter reagerer med self-proteiner og fremme en autoimmun-lignende tilstand og hypertension. Vi har udviklet og optimeret state-of-the-art metoder til at studere DC funktion i hypertension. Her, vi leverer en detaljeret protokol for isolation, i in vitro behandling med forhøjet natrium og adoptiv overførsel af murine milt CD11c⁺ celler til recipient mus til at undersøge deres rolle i hypertension.

Introduction

Overskydende kosten salt er en stor risikofaktor for hypertension. ^{1 , 2} the American Heart Association anbefaler op til 2.300 milligram (mg) natrium (Na⁺) indtag pr. dag, dog; mindre end 10% af den amerikanske befolkning bemærker denne henstilling. ^{3 , 4} beskedne reduktioner i Na⁺ indtag sænke blodtrykket og mindske de årlige nye tilfælde af koronar hjertesygdomme og slagtilfælde i USA med 20%. ⁵ et stort problem med overskydende salt forbrug er, at 50% af befolkningens hypertensive udstiller salt-følsomhed, defineret som en 10 mmHg stigning i blodtrykket efter Na^{Na+ lastning eller et lignende fald i blodtrykket +} begrænsning og diurese. ⁶ salt-følsomhed også forekommer hos 25% af normotensive personer, og er en uafhængig prædiktor for død og kardiovaskulære hændelser. ^{7 , 8} salt-sensing mekanismer i forhøjet blodtryk med nyre er blevet godt undersøgt; Nylige undersøgelser tyder dog på at immunceller kan fornemme Na⁺. ^{9 , 10}

Seneste beviser tyder på, at ændringer i ekstra renal Na⁺ håndtering kan forårsage ophobning af Na⁺ i interstitium og fremme inflammation. ^{11 , 12} vores laboratorium og andre har vist, at celler af både medfødte og adaptive immunsystem bidrager til forværring af hypertension. ^{9 , 13 , 14 , 15} forskellige hypertensive stimuli, herunder angiotensin II, noradrenalin og salt årsag makrofager, monocytter og T lymfocytter til at infiltrere den nyre og vaskulatur og fremme Na⁺ fastholdelse, vasokonstriktion, blodtryk elevation og ende-orgel skade. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} i forudgående undersøgelser, vi fandt, at DCs akkumulerer isolevuglandin (IsoLG)-protein adukter svar på forskellige hypertensive stimuli herunder angiotensin II og DOCA-salt hypertension. ¹⁴ IsoLGs er meget reaktive produkter af lipid fedtstoffer, der hurtigt og kovalent addukt til lysines på proteiner og deres ophobning er forbundet med DC aktivering. ¹⁴ vi har for nylig etableret, forhøjet Na⁺ er en potent stimulus for IsoLG-protein addukt dannelse i murine DCs.⁹ Na⁺ indrejse i DCs er medieret gennem amilorid følsomme transportvirksomheder. Na⁺ er derefter veksles til calcium (Ca^{2 +}) via Na⁺/Ca^{2 +} veksleren. Ca^{2 +} aktiverer protein kinase C (PKC) som aktiverer NADPH oxidase fører til øget superoxid (O₂^{· -}) og IsoLG-protein addukt dannelse. ⁹ adoptiv overførsel af salt-eksponerede DCs primtal hypertension som svar på en sub pressorstoffer dosis af angiotensin II. ⁹

Identifikation af CD11c⁺ DCs fra væv har været tidligere begrænset til Immunhistokemi og RT-PCR, og isolering af DCs har været begrænset til celle sortering ved flowcytometri. Selv om strømmen flowcytometri celle sortering er en kraftfuld metode til isolering af immunceller, det er dyrt og tidskrævende, og fører til et lavt udbytte af levedygtige celler. Derfor, vi har optimeret en trin for trin protokol for væv fordøjelse, in vitro stimulation og adoptiv overførsel af CD11c⁺ DCs at studere hypertension.

Protocol

Vanderbilt Universitys institutionelle Animal Care og brug Udvalget har godkendt de procedurer, der er beskrevet heri. Mus er opstaldet og plejes i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (nationale akademier presse. Revideret 2010).

1. isolering af milt fra mus

1. Forberede 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvat, 50 µM β-mercaptoethanol og 1% penicillin/streptomycin.
2. Aflive 10 – 12 ugers-gamle C57bl/6 mandlige mus af CO₂ indånding. Spray bryst og sider af musen med 70% ethanol. På venstre side, Åbn forsigtigt huden og bughulen at eksponere milten.
3. Ved hjælp af små pincet, forsigtigt flytte tarmene og leveren til venstre side af musen, og ved hjælp af fine saks forsigtigt punktafgifter milten.
   Bemærk: Dette trin skal gøres meget omhyggeligt, som skader på mave-tarmkanalen kan fremkalde forurening.
4. Placer hver skåret milten i mærket 15 mL konisk tube indeholder 3 mL af RPMI 1640 medium.

2. generation af enkelt celle suspensioner fra milt

Bemærk: Milten kan adskilles i en enkelt cellesuspension ved at kombinere mekaniske dissociation plus Enzymatisk nedbrydning.

1. Forbered milt fordøjelsen løsning ved at tilføje collagenase D (1 mg/mL; 0,29 U/mg frysetørret) og DNase I (0,1 mg/mL) til forberedt RPMI 1640 medium (Se trin 1.1)
2. Bruge pincet til at overføre milten i en C rør (dissociation tube) indeholder 3 mL af milten fordøjelsen løsning.
3. Udfør mekaniske dissociation ved hjælp af en semi-automatiske homogeniseringsapparat ifølge producentens anvisninger.
   1. Sted C røret på den semi-automatiske homogeniseringsapparat, at sikre, at C rør er tæt placeret på den roterende arm. Når C rør er placeret, skal du trykke på startknappen på den semi-automatiske homogeniseringsapparat til at køre milt 04.01 protokollen for 60 s.
      Bemærk: Mekanisk dissociation kan også udføres ved at anbringe en 40 μm filter på toppen af en 50 mL konisk slange og forsigtigt slibning milten gennem filteret. Efter slibning milten, gennem skyl filteret 40 µm med 10 mL af RPMI media.
4. Efter mekanisk dissociation, frigøre rør fra homogeniseringsapparat og udføre den enzymatiske fordøjelsen. Inkuber prøver i 15 min. ved 37 ° C under kontinuerlig rotation (20 rpm).
5. Opløsningen overføres når der afpipetteres i en 50 mL konisk tube efter filtrering gennem et 40 µm si. Vask 40 µm sien med 10 mL Dulbeccos PBS (dPBS). Centrifugeres celler ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
6. Efter centrifugering, Aspirér supernatanten helt og vaske pelleten ved resuspending i 10 mL af dPBS. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.

3. isolering af CD11c⁺ DCs fra milt enkelt cellesuspension

1. Resuspenderes celle i 5 mL af dPBS og tæller antallet af celler ved hjælp af en hemocytometer og trypan blå udstødelse.
2. Sammenpresse cellerne ved centrifugering på 300 x gi 10 min. ved 4 ° C.
3. Opsug supernatanten helt og resuspend pellet i 400 µL af magnetisk aktiveret celle-sortering (MLA) buffer.
4. Tilsæt 100 µL af CD11c microbeads (Se Tabel af materialer) pr. 1 x 10⁸ celler.
5. Vortex cellesuspension og inkuberes i 10 min. i køleskab ved 4 ° C.
6. Der tilsættes 10 mL af MACs buffer til at vaske cellerne. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
7. Opsug supernatanten helt og resuspend i 500 µL af MACs buffer.

4. magnetisk Separation af CD11c⁺ DCs

Bemærk: Magnetisk separation er udført manuelt med en magnetisk separator (Se Tabel af materialer) udstyret med LS kolonner. Magnetisk separation kan også udføres automatisk med et automatiseret magnetisk separator. (Se Tabel af materialer).

1. Markere kolonnen LS magnetfelt MACs separator og en 15 mL konisk slange under hver kolonne til at indsamle gennemstrømnings.
2. Skylles kolonnen LS med 3 mL buffer.
3. Placer cellesuspension til hver kolonne, LS og indsamle den flow-gennem umærkede celler.
4. Vaske kolonnen LS med 3 mL af MACs buffer indsamling umærkede cellerne, der passerer gennem. Vaske kolonnen LS 2 gange mere.
5. Fjern kolonnen LS fra den magnetisk separator. Der tilsættes 5 mL af MACs buffer til hver kolonne og straks skylle de magnetisk mærket celler af fast kaster kolonnen LS ind i en ren 15 mL konisk slange.
   Bemærk: Det er vigtigt at udføre en dobbelt isolation af CD11c celler til at opnå en høj renhed cellesuspension. Derfor gentage trin 3.1 gennem 4.5. og reference figur 4 for renhedskriterier. Dette trin forbedrer renheden af CD11c⁺ celler til 90-95%.
6. Bestemme CD11c⁺ DC nummer på en hemocytometer, der benytter trypan blå udstødelse. Fortynd den celle prøve på en 1:1 fortynding i 0,4% trypan blå løsning.
   Bemærk: ikke-levedygtige celler vil være farves blå, mens levedygtige celler forbliver unstained.
   1. Gør du omhyggeligt udfylde en hemocytometer med 10 µL af prøveopløsning celle og Inkuber i 1 minut.
   2. Tælle celler i 4 pladser i 1 x 1 mm² her i salen, der er indlæst for at bestemme levedygtige celle nummer.

5. i Vitro høj Salt behandling af CD11c⁺ DCs

1. Forberede DC dyrkningsmediet ved at føje 10% FBS, 0.1 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvat, 50 µM β-mercaptoethanol og 1% penicillin/streptomycin til 500 mL 1640 RPMI.
2. Forbered 10 x DC høje salt celle kultur medier (400 mM) ved vejning ud 1,17 g NaCl og placere det i en steril 50 mL falcon tube. Der tilsættes 50 mL sterilt DC celle kultur medier (udarbejdet i trin 5.1) til 50 mL falcon tube og vortex indtil NaCl er i opløsning.
3. Straks filtrere det høje salt DC Kulturmedier ved hjælp af vakuum filtrering gennem et 0,2 μm filter i en celle kultur hætte.
4. Der centrifugeres hver cellesuspension fra milt ved 300 x g i 10 min. ved 4 c. Resuspend hver celle pellet i DC kultur medier i en koncentration på 1 x 10⁶ celler/mL.
5. Tilsæt 900 μl (ca 1 x 10⁶ celler) af DC suspension i en 24-godt flad bund Falcon plade. Tilsæt 100 µL af høje salt DC dyrkningsmedier til hver brønd for en endelige natriumkoncentrationen af 190 mM. Etiket pladen og sted i et 37 ° C humified CO₂ inkubator for 48 h.

6. adoptiv overførsel af højt saltindhold behandlet CD11c⁺ DCs

1. Efter in vitro stimulation for 48 h humified fjerne pladen fra 37 ° C CO₂ inkubator.
2. Afpipetteres celle kultur medierne op og ned til resuspend CD11c⁺ DCs. Pipette alle CD11c⁺ DC suspension i en tilsvarende mærket 1,6 mL tube. Gentag dette trin for hver enkelt godt belagt.
3. Centrifugeres hver CD11c⁺ DC suspension ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Opsug supernatanten. Resuspenderes DC med 100 µL i sterile dPBS.
4. Draw DC suspension i en 1 mL sprøjten udstyret med en 27 G ½ tomme nål.
5. Placer de naive mandlige 10 uger gamle C57bl/6 mus under 2% isofluran til at opnå en stabil kirurgisk fly. Kontrollere niveauet af anæstesi med manglen på pedal refleks. Når en stabil kirurgisk flyet er opnået, langsomt og omhyggeligt indføre nålen ind i retro-orbital rummet i en vinkel på ca 30°.
   Bemærk: Facet af 27 G nålen skal peger nedad, væk fra øjet, at forhindre okulær skader.
6. Langsomt og jævnt injicere CD11c⁺ DC suspension (ca 1 x 10⁶ celler). Når injektionen er færdig, skal du forsigtigt fjerne nålen for retro-orbital plads at være bevidst ikke beskadige øjet.
   Bemærk: Efter injektionen, bør der være lidt eller ingen blødning. Adoptiv overførsel af CD11c⁺ DCs kan også udføres ved hjælp af en I.V. metode til injektion (fx hale vene). Control mus modtage CD11c⁺ DCs, der var kulturperler i normal salt medier.
7. Fjerne mus fra næsen kegle og overvåge dem for ca. 30 min. under genoprettelse fra anæstesi.

7. forberedelse af 14 dages lavdosis Angiotensin II (140 ng/kg/min)

1. Forbered angiotensin II buffer ved at tilføje 500 μL af 5 M NaCl og 300 μL af eddikesyre. Quantum Satis (QS) op til 30 mL deioniseret vand H₂0.
2. Opløse angiotensin II til 5 mg/mL stamopløsning med angiotensin II buffer. Fortynd angiotensin II stamopløsning med ekstra buffer til at opnå en endelig koncentration, sådan at den osmotiske minipump vil levere angiotensin II i en hastighed på 140 ng/kg/min efter kropsvægt hver mus.
   Bemærk: Væsentlige Angiotensin II (mg) = (musen vægt (g) x 0,2 mg / dag x 14 dage) / 1.000
   Rede Angiotensin II (mg) = (væsentlige angiotensin II x 260 µL) / pumpe sats (0,25 μL/hr)
   Angiotensin II lager volumen (μL) = parat angiotensin II / lager koncentration (5 mg/mL) x 1,000
   Fortynd volumen (μL) = 270 - angiotensin II lager volumen
3. Tilføje angiotensin II lager volumen til det fortyndede (angiotensin II buffer) baseret på de mængder, der er beregnet i trin 7.2.
4. Under en steril celle kultur hætte, åbne osmotisk minipump.
5. Tilsæt fortyndede angiotensin II løsning og udvise nogen luft fra sprøjte og kanyle. Indsæt den medfølgende nål ind i bunden af den osmotiske minipump og langsomt injicere angiotensin II løsning mens langsomt og omhyggeligt tilbagetrækningskraften nålen fra blæren.
6. Sæt osmotisk minipump hovedet ind i osmotisk blæren helt, opmærksomhed ikke at få nogen luft ind i blæren.

8. implantation af 14 dages lavdosis Angiotensin II osmotisk Minipumps

1. Ti dage efter adoptiv overførsel af CD11c⁺ DCs, sted mus i en isofluran kammer at indlede anæstesi og derefter flytte mus til næsen kegle til løbende modtager 2% isofluran for at opnå og opretholde et passende kirurgisk fly.
2. Fjern skind langs den dorsale side af halsen med neglesaks til at forberede operationsstedet. Ren glatbarberet området med 70% ethanol efterfulgt af 7,5% betadine forud for starten på operation.
3. Oprette et lille snit (ca. 1,5 cm) i huden. Indsæt hemostats i snittet til at oprette en subkutan lomme til placeringen af den osmotiske minipump.
4. Indsætte minipump ind i subkutane lommen. Tæt huden sår med 2-3 kirurgiske hæfteklammer og anvende en anden anvendelse af 7,5% betadine på såret og staples til at forhindre infektion.
5. Overvåge mus i 30-60 min. under genoprettelse fra anæstesi før returnere dem til deres bure.
   Bemærk: Mus skal overvåges op til 3 – 4 dage efter implantation af osmotisk minipump.

9. isolering af milt af modtagerens mus for Flow Cytometric analyse

1. Efter 14 dage af lav-dosis angiotensin II infusion, isolere behandlet milt fra mus modtage in vitro-højt saltindhold DCs af adoptiv overførsel. Følg ovenstående præcise trin ovenfor (trin 1 og 2).

10. overflade farvning

1. Overføre splenocytes, der er genopslemmes i 1 x PBS til en polystyren FACS tube og centrifugeres ved 350 x g i 8 min. ved 4 ° C. Aspirat supernatanten efter centrifugering. Vaskes to gange med 1 mL af MACs Buffer og centrifugering (350 x g, 8 min, 4 ° C).
   1. Opdele splenocytes ligeledes i forskellige polystyren FACS rør baseret på antallet af flow cytometric paneler ønskes.
2. For at udføre Live/døde celle levedygtighed farvning, cellerne vaskes med 1 x PBS og centrifuge (350 x g, 8 min, 4 ° C). Resuspend i 1 mL PBS, 1 x og tilføje 1 µL af en celle-levedygtighed pletten (Se materialer tabel). Inkuber i 15 min. ved 4 ° C (køleskab eller på is) dækket i folie for at beskytte mod lys.
3. Under inkubation af celle levedygtighed pletten, forberede cocktail af antistoffer til cellens overflade farvning i et passende volumen af MACS Buffer.
4. Cellerne vaskes med 1 mL af MACS Buffer, centrifuge (350 x g, 8 min, 4 ° C), og pelleten hver celle pellet med 100 µL antistof cocktail. Inkuber beskyttet mod lys for 30 min. ved 4 ° C.
   Bemærk: Hver flow flowcytometri antistof er unik, og det er meget nyttigt og anbefales at bestemme den optimale mængde antistof behov ved at udføre en dosis titreringskurven for hver specifikke antistof.
5. Cellerne vaskes to gange med 1 mL af MACS buffer og resuspend splenocytes i en passende mængde MACS Buffer for flow cytometric analyse.

Representative Results

Figur 1 repræsenterer en skematisk af trinene beskrevet ovenfor. Isolerede murine milt er sorteret for CD11c⁺ DCs af magnetiske celle sortering og forgyldt i enten normale salt medier (NS; 150 mmol NaCl) eller høje salt medier (HS; 190 mmol NaCl) for 48 h. CD11c⁺ DCs overføres derefter adoptively af retro-orbital injektion til naive recipient mus. Ti dage senere, er mus implanteret med osmotisk minipumps for lav-dosis angiotensin II (140 ng/kg/min) infusion i 14 dage. Under 14 dages infusion af angiotensin II, er blodtryk registreret af radio telemetry eller hale-cuff plethysmography.

En typisk blodtryk analyse er repræsenteret i figur 2 (modificeret fra Barbaro et al.⁹) følgende adoptiv overførsel af DCs og osmotisk minipumps for lav-dosis angiotensin II infusion er implanteret. Bemærk, denne lav dosis af angiotensin II (140 ng/kg/min) er et sub pressorstoffer dosis, der ikke øger blodtrykket i en normal mus. Mus modtager normal salt behandlede CD11c⁺ DCs (sorte cirkler) opretholde et normalt blodtryk under angiotensin II infusion, mens mus modtage højt salt behandlede CD11c⁺ DCs (røde cirkler) udstille en stigning i systolisk blodtryk. Figur 2 illustrerer, at høje salt behandlet CD11c⁺ DCs prime hypertension som svar på en sub pressorstoffer dosis af angiotensin II.

At bestemme renhed af den isolerede CD11c⁺ celler, vi udførte flow flowcytometri analyse ved hjælp af en gating strategi illustreret i figur 3A. Vi fandt, at i forhold til den samlede splenocytes, vi opnåede øget berigelse af CD11c⁺ celler (fig. 3B). Vi udnyttede forskellige CD11c microbead koncentrationer for at foretage fejlfinding af producentens protokol i figur 4. Efter magnetisk separation af splenocytes ved hjælp af 100 μL (figur 4A), 200 μl (fig. 4B) eller 300 μL (fig. 4C) CD11c microbeads udbytter omkring 65%, 55% og 50% af CD11c⁺ positive celler, henholdsvis. Vi derefter inkluderet en FcR blocker (5 μl/milten) + 100 μL af CD11c microbead, magnetisk adskilt, og fandt at blokade af FcR udbytter ca 65% CD11c positive celler (figur 4D). I yderligere eksperimenter, vi inkuberes splenocytes i 100 μl CD11c microbeads og magnetiske adskilt gennem en LS kolonne. Vi derefter inkuberes i adskilte celler med en ekstra 100 μL af CD11c microbeads og igen adskilt gennem en LS kolonne. Dobbelt isolation af splenocytes gav 92% CD11c⁺ celler (figur 4E).

Figur 1 : Illustration af adoptiv overførsel af in vitro-behandlet CD11c ⁺ DCs. CD11c⁺ DCs er isoleret fra milt af mus og forgyldt i enten normale salt eller høje salt medier til 24 h. CD11c⁺ DCs derefter adoptively overføres retro-orbitally til naive recipient mus. En osmotisk minipump infusion af lav-dosis angiotensin II er implanteret og blodtryk overvåges for 14 dage. Dette tal er tilpasset fra Barbaro mfl.) ⁹. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Effekten af høje salt behandlet CD11c ⁺ DCs på systolisk blodtryk. Dendritiske celler blev isoleret og kulturperler i normal salt (NS) eller høje salt (HS) for 48 h. DCs blev adoptively overført til vildtype naive mus. Ang II minipumps (140 ng/min) blev implanteret og blodtryk overvåges af radio telemetry. Systolisk blodtryk (SBP) målt ved radio telemetry (gennemsnit ± SEM). Dette tal er tilpasset fra Barbaro et al.⁹venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Flow cytometric analyse af magnetisk adskilt splenocytes. (A) Gating strategi definere analyse af CD11c + DC befolkning. Celler er adskilt fra debris og levende celler er valgt baseret på udelukkelse af Live/døde celle pletten. Singlet celler er markeret og derefter analyseret for CD45 positivitet. CD45 celler er derefter analyseret for CD11c. (B) efter magnetisk separation, er der betydelig berigelse af CD11c + celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Flow cytometric analyse af magnetisk adskilt CD11c⁺ splenocytes efter forskellige isolation protokoller. Celler blev adskilt fra debris og levende celler. Levende celler blev analyseret for-Ab og CD11c positivitet. (A) % af CD11c⁺ celler følge magnetisk separation, der blev isoleret med 100 μL, (B) 200 µL, (C) 300 μL af CD11c microbeads. (D) % af CD11c⁺ celler følge magnetisk separation, der blev isoleret med blokade af FK (anti-FK; 5 μl) + 100 μL CD11c microbeads. (E) % af CD11c⁺ celler følge magnetisk separation, der blev isoleret med dobbelt magnetisk celle sortering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I den nuværende protokol, vi har optimeret procedurer for at isolere CD11c⁺ DCs fra milt af mus og adoptively overføre dem til naive dyr at studere DCs rolle i salt-induceret hypertension. Denne protokol kan tilpasses til at isolere og adoptively overføre andre immun celle subsets herunder makrofager, monocytter og adaptive immunceller, herunder T- og B-lymfocytter. Vi har optimeret milt fordøjelsen proces for at opnå tilstrækkelig celle overlevelse og stabilitet af DC overflade udtryk markører. Derudover har vi optimeret protokol for in vitro stimulation af murine DCs med forhøjet natrium for optimal DC overlevelse.

Et afgørende skridt i denne protokol er magnetisk celle sortering. Magnetiske celle sortering er en kraftfuld og praktisk redskab til at isolere bestemte murine celletyper til at studere immun cellefunktion i sygdommen. Men det er baseret på grundlæggende celle overflade udtryk markører herunder CD11c, der udtrykkes ofte på mere end én immun celletype og ofte giver en mindre end ønskeligt bestemt celle berigelse. Således, for applikationer, der kræver en meget specifik befolkning af celler, kan det være nødvendigt at plette med flere antistoffer og sortere ved flowcytometri at fjerne forurenende celler. Det er også vigtigt at bekræfte berigelse og renhed af isolerede celler ved hjælp af flowcytometri som vist i figur 3 og figur 4. I den nuværende protokol, har vi udført flere trin til fejlfinding herunder brugen af forskellige koncentrationer af CD11c perler, blokaden af FK, og anvende en anden magnetiske celle sortering protokol til de isolerede celler. Vi fandt, at dobbelt magnetisk celle sortering opnåede den højeste grad af CD11c⁺ celle renhed.

En anden afgørende skridt i forståelsen af funktionen af isolerede DCs er in vitro stimulation med højt saltindhold og kultur. Mens vi finde at dette aktiverer DCs får dem til at prædisponere mus til hypertension,⁹ in vitro stimulation og kultur kan forårsage celledød og indføre andre betingelser, der kan potentielt forstyrre forskningsresultater. Desuden, for at få nok levedygtige DCs, kan det være nødvendigt at pool milt af flere mus til at opnå en vellykket adoptiv overførsel. For at eliminere potentielle artefakt virkningerne af ex vivo dyrkning af celler, kan det være nødvendigt at overføre adoptively DCs isoleret fra høje salt-fed mus. I tidligere undersøgelser, vi isoleret DCs, der har været stimuleret in vivo på mus infunderes med angiotensin II og fandt, at disse førsteklasses hypertension i modtagerens mus. ¹⁴ i fremtidige undersøgelser, vi kan stimulere DCs in vivo, ved hjælp af salt-induceret hypertension herunder DOCA salt eller L-navn/høj salt og afgøre, om de aktivere T-celler og prime hypertension.

En anden begrænsning af denne protokol er relateret til det tekniske aspekt af vellykket intravenøs adoptiv overførsel af immunceller. Retro-orbital vene injektion af DCs kan være vanskelige og bør udføres af en højtuddannet kirurg. Alternativt, adoptively overførsel af DCs kan opnås gennem halen vene injektion men denne tendens til at være lettere i hvid sammenlignet med sorte mus.

Trods disse tekniske begrænsninger er magnetiske celle sortering og adoptiv overførsel af DCs en ekstremt kraftfuld teknik, der giver mulighed for identificering og karakterisering af den funktionelle rolle, DCs i cardio-renal sygdomstilstande. Det er vigtigt at evaluere engraftment og målsøgende af celler i forskellige organer relateret til hjerte-kar-sygdom efter adoptiv overførsel. I tidligere undersøgelser overføres vi adoptively DCs fra mus transgene for forbedret grøn fluorescerende proteiner til naive recipient mus. Vi derefter udført flowcytometri af forskellige væv i de modtagende mus ti dage senere og fandt, at disse celler overvejende ophobes i milten af recipient mus og i mindre omfang i nyre og aorta. Dette blev øget, hvis donor mus behandlet med angiotensin II. Den relative engraftment af normale versus salt-behandlede DCs og specifikke væv websteder stadig behov skal undersøges.

Afslutningsvis har vi skitseret og optimeret en detaljeret og reproducerbare protokol for at magnetisk adskille, adoptively overførsel, og vurdere DC befolkninger ved flowcytometri. Denne protokol kan anvendes til andre immun cellepopulationer (med nogle ændringer) og andre modeller af hjerte-kar-sygdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030