Summary
Hier presenteren we een protocol om te isoleren van dendritische cellen uit lymfkliertest milt door magnetische cel Sorteren en latere adoptief overdracht naïef muizen. Het model van hoge-zout geactiveerde dendritische cellen werd gekozen om de stapsgewijze procedures voor de overdracht van de geadopteerde en stroom cytometry uitleggen.
Abstract
Teveel zout inname bijdraagt tot ontsteking en speelt een vitale rol in de ontwikkeling van hypertensie. Eerder vonden we dat antigeen-presenteren dendritische cellen (DC's) verhoogde extracellulaire natrium leidt tot het activeren van de NADPH oxidase en vorming van isolevuglandin (IsoLG) kunnen zin-eiwit adducten. Deze IsoLG-eiwit adducten reageren met zelf-eiwitten en een auto-immune-achtige toestand en hypertensie bevorderen. Wij hebben ontwikkeld en geoptimaliseerd state-of-the-art methoden om te bestuderen van DC functie in hypertensie. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor isolatie, in vitro behandeling met de verhoogde natrium en adoptief overdracht van lymfkliertest milt CD11c+ cellen in ontvangende muizen te bestuderen van hun rol in hypertensie.
Introduction
Overtollige dieet zout is een belangrijke risicofactor voor hoge bloeddruk. 1 , 2 the American Heart Association adviseert een maximum van 2.300 milligram (mg), natrium (Na+) inname per dag, echter; minder dan 10% van de Amerikaanse bevolking merkt deze aanbeveling. 3 , 4 bescheiden verlaging van de+ Na inname de bloeddruk verlagen en de jaarlijkse nieuwe gevallen van hart-en vaatziekten en beroerte in de VS met 20% verminderen. 5 een groot probleem met overmatige consumptie van zout is dat 50% van de bevolking van hypertensieve zout-gevoeligheid vertoont, gedefinieerd als een stijging van de bloeddruk Na+ laden of een gelijkaardige daling van de bloeddruk na na Namet 10 mmHg + beperking en diurese. 6 zout-gevoeligheid ook optreedt in 25% van de normotensive personen, en is een onafhankelijke voorspeller van dood en cardiovasculaire gebeurtenissen. 7 , 8 zout-sensing mechanismen in hypertensie waarbij de nieren zijn goed bestudeerd; recente studies suggereren echter dat de immuuncellen nb+kunnen voelen. 9 , 10
Recent bewijs suggereert dat veranderingen in extra renale nb+ behandeling kunnen leiden ophoping van nb+ in het interstitium tot en bevordering van ontsteking. 11 , 12 ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat de cellen van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem aan de verergering van hypertensie bijdragen. 9 , 13 , 14 , 15 verschillende hypertensieve stimuli, met inbegrip van angiotensine II, noradrenaline en zout oorzaak macrofagen, monocyten en T-lymfocyten infiltreren de nier- en therapieën te bevorderen nb+ retentie, vasoconstrictie, bloeddruk hoogte en einde-orgel schade. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 in voorafgaande studies, vonden we dat DCs isolevuglandin (IsoLG accumuleren)-eiwit adducten in reactie op verschillende stimuli van hypertensieve met inbegrip van angiotensine II en DOCA-zout hypertensie. 14 IsoLGs zijn zeer reactieve producten van lipide peroxidatie die snel en covalent te lysines op eiwitten adduct en hun accumulatie wordt geassocieerd met DC activering. 14 we hebben onlangs vastgesteld dat verhoogde nb+ een krachtige stimulans voor IsoLG-eiwit is adduct vorming in RattenUitrustingen DCs.9 nb+ inwerkingtreding DCs is bemiddeld door amiloride gevoelige vervoerders. NB+ wordt vervolgens omgewisseld voor calcium (Ca2 +) via de nb+/CA2 + warmtewisselaar. CA2 + wordt geactiveerd proteïne kinase, C (PKC) die activeert de NADPH oxidase leidt tot verhoogde superoxide (O2· -) en IsoLG-eiwit adduct vorming. 9 adoptief overdracht van zout-blootgesteld DCs priemgetallen hypertensie in reactie op een sub pressor dosis van angiotensine II. 9
Identificatie van CD11c+ DCs uit weefsels is eerder beperkt immunohistochemistry en RT-PCR, en isolatie van DCs is beperkt tot de cel Sorteren op stroom cytometry. Hoewel stroom cytometry cel Sorteren een krachtige methode voor de isolatie van immune cellen is, het is duur, tijdrovend, en leidt tot een lage rendement van levensvatbare cellen. Daarom hebben we een stap voor stap-protocol voor het weefsel spijsvertering, in vitro stimulatie en adoptief overdracht van CD11c geoptimaliseerd+ DCs te bestuderen van hypertensie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt University's institutionele Animal Care en gebruik Comité hebben de hierin beschreven procedures goedgekeurd. Muizen zijn gehuisvest en verzorgd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren (National Academies Press. Herziene 2010).
1. isolatie van milt van muizen
- Bereiden 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvaat, 50 µM β-mercaptoethanol en 1% penicilline/streptomycine.
- Euthanaseren van 10 – 12 week-oude C57bl/6 mannelijke muizen bij CO2 inademing. Spray de borst en zijkanten van de muis met 70% ethanol. Open zorgvuldig op de linker kant, de huid en de peritoneale spouw aan het blootstellen van de milt.
- Behulp van kleine pincet, de darmen en de lever voorzichtig te verplaatsen naar de linkerkant van de muis, en fijne schaar zachtjes accijnzen de milt.
Opmerking: Deze stap moet worden gedaan zeer zorgvuldig zoals schade aan de gastro-intestinale tractus kan besmetting veroorzaken. - Plaats elke weggesneden milt in gelabelde 15 mL conische buis met 3 mL RPMI 1640 voedingsbodem.
2. productie van eencellige schorsingen van milt
Opmerking: De milt kan in een enkele celsuspensie worden losgekoppeld door een combinatie van mechanische dissociatie plus enzymatische spijsvertering.
- Bereid de milt spijsvertering-oplossing door het toevoegen van collagenase D (1 mg/mL; 0.29 U/mg gelyofiliseerde vorm) en DNase I (0,1 mg/mL) bij geprepareerd RPMI 1640 medium (zie stap 1.1)
- Pincet gebruiken om de milt in een C-buis (dissociatie buis) met 3 mL milt spijsvertering oplossing.
-
Het uitvoeren van de mechanische dissociatie met behulp van een semi-automatische homogenizer volgens de instructies van de fabrikant.
- Plaats de C-buis op de semi-automatische homogenizer, ervoor te zorgen dat de C-buis strak op de roterende arm wordt geplaatst. Zodra de C-tube wordt geplaatst, drukt u op de startknop op de semi-automatische homogenizer om uit te voeren van de milt 04.01 protocol voor 60 s.
Opmerking: Mechanische dissociatie kan ook worden uitgevoerd door het plaatsen van een 40 μm-filter op de top van een conische tube van 50 mL en voorzichtig slijpen de milt door de filter. Spoel na het slijpen van de milt, door het filter van 40 µm met 10 mL van RPMI media.
- Plaats de C-buis op de semi-automatische homogenizer, ervoor te zorgen dat de C-buis strak op de roterende arm wordt geplaatst. Zodra de C-tube wordt geplaatst, drukt u op de startknop op de semi-automatische homogenizer om uit te voeren van de milt 04.01 protocol voor 60 s.
- Na mechanische dissociatie, loskoppelen van de buis van de homogenizer en het uitvoeren van de enzymatische spijsvertering. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 37 ° C onder continue rotatie (20 rpm).
- Breng de oplossing kwantitatief door pipetteren in een conische buis van 50 mL na de filtratie door een zeef van 40 µm. Wassen van de 40 µm zeef met 10 mL Dulbecco van PBS (dPBS). Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Na centrifugeren, gecombineerd het supernatant volledig en spoelen de pellet door resuspending in 10 mL dPBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
3. isolatie van in CD11c+ DCs van milt eencellige schorsing
- Resuspendeer de pellet cel in 5 mL van de dPBS en het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blue uitsluiting.
- Pellet de cellen door centrifugeren 300 x ggedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Gecombineerd volledig het supernatant en resuspendeer de pellet in 400 µL van magnetisch geactiveerde cel-sorteren (MACs) buffer.
- Voeg 100 µL van CD11c microbeads (Zie Tabel van materialen) per 1 x 108 cellen.
- Vortex de celsuspensie en incubeer gedurende 10 minuten in de koelkast bij 4 ° C.
- Voeg 10 mL van MACs buffer te wassen van de cellen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Gecombineerd volledig het supernatant en resuspendeer in 500 µL van MACs buffer.
4. magnetische scheiding van CD11c+ DCs
Opmerking: Magnetische scheiding handmatig wordt gedaan met een magnetische scheidingsteken (Zie Tabel van materialen) uitgerust met LS kolommen. Magnetische scheiding kan ook automatisch worden gedaan met een geautomatiseerde magnetische scheiding. (Zie Tabel van materialen).
- Plaats de LS-kolom in het magnetisch veld van MACs scheidingsteken en een conische tube van 15 mL onder elke kolom voor het verzamelen van de doorstroming.
- Spoel de LS-kolom met 3 mL buffer.
- Plaats de celsuspensie op elke kolom van LS en verzamelen de doorstroming met labelloze cellen.
- Was de kolom van LS met 3 mL MACs buffer verzamelen de labelloze cellen die passeren. Was de LS kolom 2 vaker.
- Verwijder de LS-kolom uit de magnetische scheidingsteken. Voeg 5 mL van MACs buffer aan elke kolom en onmiddellijk spoelen de magnetisch gelabelde cellen door de LS-kolom in een schone 15 mL conische buis stevig te storten.
Opmerking: Het is belangrijk om uit te voeren een dubbele isolatie van CD11c cellen te verkrijgen van een hoge zuiverheid celsuspensie. Daarom herhaal stap 3.1 via 4.5. en referentie van Figuur 4 voor zuiverheidscriteria. Hierdoor verbetert de zuiverheid van CD11c+ cellen tot 90-95%. -
Bepalen CD11c+ DC nummer op een hemocytometer met behulp van trypan blauwe uitsluiting. Verdun het monster van de cel bij een verdunning 1:1 in 0,4% trypan blauwe oplossing.
Opmerking: niet-levensvatbare cellen zal blauw worden gekleurd terwijl levensvatbare cellen onbevlekt zal blijven.- Om dit te doen, voorzichtig een hemocytometer vullen met 10 µL van de cel monsterverdunning en incubeer gedurende 1 minuut.
- Cellen in 4 vierkantjes van 1 x 1 mm,2 in de kamer die is geladen om te bepalen van het aantal levensvatbare cellen te tellen.
5. in Vitro hoge zout behandelingvan CD11c+ DCs
- DC-kweekmedium bereiden door 10% FBS, 0.1 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvaat, 50 µM β-mercaptoethanol en 1% penicilline/streptomycine toe te voegen aan 500 mL 1640 RPMI.
- 10 x DC hoog zout cel voedingsbodems (400 mM) voor te bereiden door weging van 1,17 g van NaCl en plaatsen het in een tube van de falcon steriele 50 mL. Voeg 50 mL steriele DC cel voedingsbodems (bereid in stap 5.1) aan de falcon tube van 50 mL en vortex totdat de NaCl in oplossing.
- Onmiddellijk filtermedia de hoge zout DC cultuur met behulp van vacuüm filtratie door een 0,2 micrometer filter in een cel cultuur kap.
- Centrifugeer elke celsuspensie van de milt bij 300 x g gedurende 10 minuten bij een temperatuur van 4ºC. Resuspendeer de pellet van elke cel in DC voedingsbodems bij een concentratie van 1 x 106 cellen/mL.
- Pipetteer 900 μL (ongeveer 1 x 106 cellen) van de DC-suspensie in een 24-well platte bodem Falcon plaat. Voeg 100 µL van hoge zout DC voedingsbodems aan elk putje voor een definitieve natrium concentratie van 190 mM. Label van de plaat en plaats in een 37 ° C humified CO2 incubator voor 48 uur.
6. adoptief overdracht van hoge zout behandeld CD11c+ DCs
- Na in vitro stimulatie voor 48 h humified verwijderen de plaat uit de 37 ° C CO2 incubator.
- Pipetteer van de cel voedingsbodems omhoog en naar beneden om resuspendeer de CD11c+ DCs. Pipetteer al de CD11c+ DC schorsing in een overeenkomt met het label tube 1.6 mL. Herhaal deze stap voor elk individu goed verguld.
- Centrifugeer elke CD11c+ DC schorsing bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie gecombineerd. Resuspendeer de pellet DC met 100 µL van steriele dPBS.
- Loting DC schorsing in een spuit van 1 mL uitgerust met een 27 G ½ inch naald.
- Plaats de naïeve mannelijke 10 week-oude C57bl/6 muizen onder 2% Isofluraan te bereiken van een stabiele chirurgische vliegtuig. Controleer het niveau van anesthesie met het ontbreken van pedaal reflex. Zodra een stabiele chirurgische vliegtuig is bereikt, langzaam en voorzichtig introduceren de naald in de retro-orbitaal ruimte onder een hoek van ongeveer 30°.
Opmerking: De schuine kant van de 27 G naald moet wijzen naar beneden, weg van het oog, oogbeschadigingen en/of schade te voorkomen. - Langzaam en vloeiend injecteren de CD11c+ DC schorsing (ongeveer 1 x 106 cellen). Zodra de injectie voltooid is, verwijder voorzichtig de naald voor de ruimte van de retro-orbitaal wordt bewust om geen schade toebrengen aan het oog.
Opmerking: Na de injectie, moet er weinig of geen bloeding. Adoptief overdracht van CD11c+ DCs kan ook worden uitgevoerd met behulp van een methode I.V. injectie (bijvoorbeeld staart ader). De muizen controle ontvangen CD11c+ DCs die werden gekweekt in normale zout media. - De muizen verwijderen uit de neus en controleren ze voor ongeveer 30 min tijdens het herstel van de verdoving.
7. bereiding van 14 dagen lage dosis angiotensine II (140 ng/kg/min)
- Bereid de angiotensine II buffer door 500 μL van 5 M NaCl en 300 μL van azijnzuur toe te voegen. Quantum Satis (QS) tot 30 mL gedeïoniseerd H20.
- Angiotensine II naar 5 mg/mL voorraadoplossing met angiotensine II buffer te ontbinden. Verdun angiotensine II stockoplossing met extra buffer om een eindconcentratie zodat de osmotische minipomp angiotensine II in een snelheid van 140 ng/kg/min volgens het lichaamsgewicht voor elke muis zal leveren.
Opmerking: Essentiële angiotensine II (mg) = (muis gewicht (g) x 0,2 mg / dag x 14 dagen) / 1.000
Bereid van angiotensine II (mg) = (essentiële angiotensine II x 260 µL) / pomp tarief (0,25 l/hr)
Angiotensine II voorraad Volume (l) = bereid angiotensine II / voorraad concentratie (5 mg/mL) x 1,000
Verdund volume (l) = 270 - angiotensine II voorraad volume - Angiotensine II voorraad volume toevoegen aan het verdunde (angiotensine II buffer) op basis van de volumes berekend in stap 7.2.
- Onder de motorkap van een steriele cel cultuur, open osmotische minipomp.
- Voeg verdunde angiotensine-II-oplossing en alle lucht uit de spuit en naald. Plaats de meegeleverde naald in de bodem van de osmotische minipomp en langzaam het injecteren van angiotensine II oplossing terwijl langzaam en zorgvuldig keuzemenu de naald uit de blaas.
- Invoegen de osmotische minipomp hoofd de osmotische blaas volledig, aandacht niet om alle lucht in de blaas.
8. het implanteren van 14 dagen lage dosis angiotensine II osmotische Minipumps
- Tien dagen na adoptie overdracht van CD11c+ DCs, plaats muizen in een zaal Isofluraan starten van anesthesie en verplaats deze muizen naar neus kegel naar 2% Isofluraan voor het bereiken en handhaven van een passende chirurgische vliegtuig continu te ontvangen.
- Verwijder de vacht langs de dorsale zijde van de nek met clippers aan chirurgische site voorbereiden. Reinig de geschoren gebied met 70% ethanol gevolgd door 7,5% betadine vóór de aanvang van de operatie.
- Maakt een kleine incisie (ongeveer 1,5 cm) in de huid. Hemostats invoegen in de snede te maken een subcutane zak voor plaatsing van de osmotische minipomp.
- De minipomp invoegen in de subcutane zak. Sluit de huid gewikkeld met 2-3 chirurgische nietjes en toepassing van een andere toepassing van 7,5% betadine op de wond en nietjes om infectie te voorkomen.
- De muizen voor 30-60 min toezien tijdens het herstel van anesthesie voordat u terugkeert hen naar hun kooien.
Opmerking: Muizen moeten worden tot 3-4 dagen na implantatie van de osmotische minipomp gecontroleerd.
9. isolatie van milt van geadresseerden muizen voor Flow cytometrische analyse
- Na 14 dagen na de lage dosis angiotensine II infusie, isoleren behandeld milt van muizen ontvangen in vitro hoog zout DCs door adoptief overdracht. De precieze stappen hierboven (stappen 1 en 2).
10. oppervlakte kleuring
-
Overdracht van splenocytes die zijn geresuspendeerde in 1 x PBS in een polystyreen FACS buis en centrifuge op 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Gecombineerd supernatans dat na het centrifugeren. Wassen tweemaal met 1 mL van MACs Buffer en centrifugeren (350 x g, 8 min, 4 ° C).
- Verdeel de splenocytes even in verschillende polystyreen FACS buizen op basis van het aantal stroom cytometrische panelen gewenst.
- Wassen als u wilt uitvoeren de Live/Dead cel levensvatbaarheid kleuring, de cellen met 1 x PBS en centrifuge (350 x g, 8 min, 4 ° C). Resuspendeer in 1 mL 1 x PBS en voeg 1 µL van een levensvatbaarheid van de cellen vlek (Zie materialen tabel). Incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C (koelkast of op ijs) bedekt met folie om te beschermen tegen licht.
- Tijdens de incubatie van de cel levensvatbaarheid vlek, door de cocktail van antilichamen te voorbereiden door het celoppervlak kleuring in een passende hoeveelheid MACS Buffer.
- Spoel de cellen met MACS Buffer, centrifuge (350 x g, 8 min, 4 ° C), 1 mL en resuspendeer de pellet van elke cel met 100 µL van het antilichaam cocktail. Incubeer beschermd tegen licht gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
Opmerking: Elke stroom cytometry antilichaam is uniek, en het is zeer nuttig en geadviseerd om te bepalen van de optimale hoeveelheid antilichaam die nodig zijn voor het uitvoeren van een dosis titratiecurve voor elke specifieke antilichaam. - Spoel de cellen tweemaal met 1 mL van MACS buffer en resuspendeer de splenocytes in een geschikte hoeveelheid van MACS Buffer voor flow cytometrische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft een schematische voorstelling van de hierboven beschreven stappen. Geïsoleerde lymfkliertest milt worden gesorteerd voor CD11c+ DCs door magnetische cel Sorteren en vergulde in normale zout media (NS; 150 mmol NaCl) of hoog zout media (HS; 190 mmol NaCl) voor 48 h. CD11c+ DCs worden vervolgens adoptively overgedragen door retro-orbitaal injectie te naïef ontvangende muizen. Tien dagen later, de muizen zijn geïmplanteerd met osmotische minipumps voor lage dosis angiotensine II (140 ng/kg/min) infusie voor 14 dagen. Tijdens de 14-daagse infusie van angiotensine II, is bloeddruk opgenomen door radio telemetrie of staart-manchet plethysmography
Een typische bloeddruk analyse wordt weergegeven in Figuur 2 (gewijzigd van Barbaro et al.9) na adoptie overdracht van DCs en osmotische minipumps voor lage dosis angiotensine II infusie worden geïmplanteerd. Van de nota, deze lage dosis van angiotensine II (140 ng/kg/min) is een sub pressor dosis die niet verhoogd bloeddruk in een normale muis. Muizen ontvangen van normale zout behandelde CD11c+ DCs (zwarte cirkels) handhaven een normale bloeddruk tijdens de infusie van angiotensine II, terwijl muizen ontvangen hoog behandelde CD11c zout+ DCs (rode cirkels) vertonen een toename in systolische bloeddruk. Figuur 2 illustreert dat hoge zout behandeld CD11c+ DCs priemgetal hypertensie in reactie op een sub pressor dosis van angiotensine II.
Om te bepalen van de zuiverheid van de geïsoleerde CD11c+ cellen, we uitgevoerd stroom cytometry analyse met behulp van een gating strategie geïllustreerd in Figuur 3A. We vonden dat in vergelijking met de totale splenocytes, we bereikt meer verrijking van CD11c+ cellen (Figuur 3B). We gebruikt verschillende concentraties van de microbead van de CD11c voor het oplossen van de fabrikant protocol in Figuur 4. Na magnetische scheiding van splenocytes met behulp van 100 μl (Figuur 4A), 200 μl (Figuur 4B) of 300 μL (Figuur 4C) van CD11c microbeads levert ongeveer 65%, 55% en 50% van CD11c+ positieve respectievelijk cellen. Wij vervolgens opgenomen een FcR blocker (5 μl/milt) + 100 μl van CD11c microbead, magnetisch gescheiden, en vond die blokkade van FcR levert ongeveer 65% CD11c positieve cellen (Figuur 4D). In extra experimenten, we splenocytes in 100 μl CD11c microbeads geïncubeerd en magnetische gescheiden door een LS-kolom. Wij vervolgens geïncubeerd de scheidt cellen met een extra 100 μl van CD11c microbeads en ook hier worden gescheiden door een LS-kolom. Dubbele isolatie van de splenocytes leverde 92% CD11c+ cellen (Figuur 4E).
Figuur 1 : Illustratie van adoptief overdracht van in vitro behandeld CD11c + DCs. CD11c+ DCs zijn geïsoleerd van de milt van muizen en verguld in beide normale zout of hoog zout media voor 24 h. CD11c+ DCs worden vervolgens adoptively overgedragen retro-orbitally in naïef ontvangende muizen. Een osmotische minipomp infusie van lage dosis angiotensine die II is geïmplanteerd en bloeddruk is gecontroleerd gedurende 14 dagen. Dit cijfer is aangepast van Barbaro et al.) 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Het effect van hoge zout behandeld CD11c + DCs op de systolische bloeddruk. Dendritische cellen werden geïsoleerd en gekweekt in normale zout (NS) of hoog zout (HS) voor 48 h. DCs werden adoptively overgebracht naar wild type naïef muizen. Ang II minipumps (140 ng/min) waren ingeplant en bloeddruk gecontroleerd door radio telemetrie. Systolische bloeddruk (SBP) gemeten door radio telemetrie (gemiddelde ± SEM). Dit percentage is aangepast van Barbaro et al.9Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Flow cytometrische analyse van magnetisch gescheiden splenocytes. (A) Gating strategie die de analyse van CD11c + DC bevolking. Cellen worden gescheiden van puin en levende cellen worden geselecteerd op basis van uitsluiting van Live/Dead cel vlek. Singlet cellen worden geselecteerd en vervolgens geanalyseerd voor CD45 positiviteit. CD45 cellen worden vervolgens geanalyseerd voor CD11c. (B) na magnetische scheiding, is er aanzienlijke verrijking van CD11c + cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Flow cytometrische analyse van magnetisch gescheiden CD11c+ splenocytes na verschillende isolatie protocollen. Cellen werden gescheiden van puin en levende cellen. Levende cellen werden geanalyseerd voor-Ab en CD11c positiviteit. (A) % van CD11c+ cellen na magnetische scheiding die werden geïsoleerd met 100 μl, (B) 200 µL, (C) 300 μL van CD11c microbeads. (D) of meer gewichtspercenten CD11c+ cellen na magnetische scheiding die werden geïsoleerd met blokkade van FcR (anti-FcR; 5 μl) + 100 μl CD11c microbeads. (E) of meer gewichtspercenten CD11c+ cellen na magnetische scheiding die werden geïsoleerd met dubbele magnetische cel sorteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het huidige protocol, hebben we procedures om te isoleren CD11c geoptimaliseerd+ DCs van milt van muizen en adoptively ze vervolgens overbrengen naar naïeve dieren te bestuderen van de rol van DCs in zout-geïnduceerde hypertensie. Dit protocol kan worden aangepast om te isoleren en adoptively overdracht andere immuun cel subsets met inbegrip van macrofagen, monocyten en adaptieve immune cellen, met inbegrip van T en B-lymfocyten. We hebben de milt spijsverteringsproces om voldoende cel overleving en stabiliteit van DC oppervlakte expressie markers geoptimaliseerd. Bovendien hebben wij het protocol voor in vitro stimulatie van lymfkliertest DCs met verhoogde natrium voor optimale DC overleving geoptimaliseerd.
Een cruciale stap in dit protocol is magnetisch cel sorteren. Magnetische cel Sorteren is een krachtige en handige tool om te isoleren van de specifieke lymfkliertest celtypes voor het bestuderen van immuun cel functie in ziekte. Echter, het is gebaseerd op fundamentele cel oppervlakte expressie markeringen met inbegrip van CD11c die vaak worden uitgedrukt op meer dan één immuun celtype en vaak levert een verrijking van minder dan wenselijk specifieke cel. Dus, voor toepassingen waarbij een zeer specifieke bevolking van cellen, het mogelijk moet vlek met verschillende antilichamen en stroom cytometry te elimineren contaminerende cellen wilt sorteren. Het is ook belangrijk om verrijking en zuiverheid van geïsoleerde cellen met behulp van stroom cytometry zoals aangegeven in Figuur 3 en 4 van de figuurte bevestigen. In het huidige protocol, die we hebben uitgevoerd verscheidene stappen voor probleemoplossing met inbegrip van het gebruik van verschillende concentraties van de CD11c parels, blokkade van FcR, en een tweede magnetische cel Sorteren protocol aan de geïsoleerde cellen toe te passen. We vonden dat dubbele magnetische cel Sorteren de hoogste graad van CD11c bereikt+ cel zuiverheid.
Een andere belangrijke stap in het begrijpen van de functie van geïsoleerde DCs is in vitro stimulatie met hoog zout en cultuur. Terwijl wij vinden dat dit DCs activeert veroorzaakt kunnen predisponeren muizen aan hypertensie,9 in vitro stimulatie en cultuur kunnen leiden tot celdood en invoering van andere omstandigheden die mogelijk met onderzoeksresultaten interfereren kunnen. Bovendien, voor het verkrijgen van voldoende levensvatbare DCs, het kan nodig zijn te zwembad milt van verschillende muizen te verkrijgen van een succesvolle adoptief overdracht. Om te elimineren van de potentiële effecten van het artefact van ex vivo kweken van cellen, kan het nodig adoptively overdracht van DCs geïsoleerd van hoog zout-gevoed muizen zijn. Voorafgaande studies, we geïsoleerd van DCs die in vivo in muizen doordrenkt met angiotensine II hebben zijn gestimuleerd en vond dat deze priemgetal hypertensie in ontvangende muizen. 14 In de toekomst studies, we kunnen stimuleren DCs in vivo met behulp van zout-geïnduceerde hypertensie, met inbegrip van DOCA zout of L-naam/hoge zout en bepalen of ze activeren van T-cellen en prime hypertensie.
Een andere beperking van dit protocol is gerelateerd aan het technische aspect van succesvolle intraveneuze adoptief overdracht van immuuncellen. Retro-orbitaal-veneuze injectie van DCs kan moeilijk en moet gebeuren door een hoog opgeleide chirurg. U kunt ook adoptively overdracht van DCs kan worden bereikt door de staart veneuze injectie maar dit neigt te zijn gemakkelijker in wit in vergelijking met zwarte muizen.
Ondanks deze technische beperkingen is magnetische cel Sorteren en adoptief overdracht van DCs een uiterst krachtige techniek waarmee identificatie en karakterisering van de functionele rol van DCs in cardio-nierziekte Staten. Het is belangrijk om engraftment en homing van cellen in verschillende organen aan hart-en vaatziekten gerelateerde na adoptie overdracht te evalueren. In eerdere studies overgedragen we adoptively DCs van muizen transgene voor Enhanced Green Fluorescent protein in naïef ontvangende muizen. We vervolgens uitgevoerd stroom cytometry van de verschillende weefsels in de ontvangende muizen tien dagen later en vond dat deze cellen overwegend in de milt van geadresseerden muizen, en in mindere mate in de nieren en de aorta ophopen. Dit werd verhoogd als de donor muis werd behandeld met angiotensine II. De relatieve engraftment van normale versus zout-behandelde DCs en de specifieke weefsel sites nog moet worden onderzocht.
Kortom, hebben we geschetst en een gedetailleerde en reproduceerbare protocol voor magnetisch scheiden, adoptively overdracht, en beoordelen van DC populaties door stroom cytometry geoptimaliseerd. Dit protocol kan worden toegepast op andere immuun cel populaties (met enkele aanpassingen) en andere modellen van hart-en vaatziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door American Heart Association verleent N.R.B. POST290900, 17SDG33670829 L.X. en de National Institutes of Health toekennen K01HL130497 A.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use protocol: Spleen 04.01 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835-030 |
References
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
- Murray, C. J., Lopez, A. D.
- Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
- Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
- He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
- Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
- Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
- Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
- Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
- Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
- Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
- Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
- Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
- Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
- Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
- Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
- Harrison, D. G., et al.
- Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
- Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).
