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Genetics

एक कोशिका आनुवंशिक तकनीक का उपयोग कर बेमिसिया टैबची के अंडे निषेचन दर का निर्धारण

Published: April 1, 2019 doi: 10.3791/59213
Automatic Translation
1, 2
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

Summary

हम 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (dapi) का उपयोग कर एक सरल साइटोजेनेटिक्स तकनीक प्रस्तुत करने के लिए निषेचन दर और प्राथमिक लिंग का अनुपात के लिए हैप्लोद्विगुणित इनवेसिव कीट बेमिसिया टेबासी।

Abstract

एसएपी चूसने सफ़ेद मक्खियों की कुछ प्रजातियों क्योंकि फसल नुकसान वे डैमेज और संयंत्र वायरस वे वेक्टर की दुनिया भर में सबसे हानिकारक स्थलीय कीट के कुछ कर रहे हैं । विभिंन वातावरण में इन प्रजातियों के जीव विज्ञान के कई अध्ययनों के बावजूद, एक प्रमुख जीवन इतिहास पैरामीटर, वंश लिंग अनुपात, थोड़ा ध्यान प्राप्त हुआ है, अभी तक जनसंख्या गतिशीलता की भविष्यवाणी के लिए महत्वपूर्ण है । बेमिसिया टैबसी के प्राथमिक लिंग अनुपात (ओपोपोजिशन पर लिंग अनुपात) की सूचना कभी नहीं दी गई है, लेकिन इस हैप्लोडिलॉयड कीट की अंडा निषेचन दर निर्धारित करके पाई जा सकती है । तकनीक ब्लीच, निर्धारण चरणों की एक श्रृंखला, और सामांय डीएनए फ्लोरोसेंट दाग, DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, एक डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोसेंट डाई) के आवेदन के साथ अंडे की dechorionation शामिल है, के लिए बाध्य करने के लिए महिला और पुरुष pronuclei । यहां, हम तकनीक प्रस्तुत करते हैं, और अपने आवेदन का एक उदाहरण है कि क्या एक एंडोसहजीवी जीवाणु, Rickettsia सपा. nr. बेल्ई ने बी. टैबचीके प्राथमिक लिंग अनुपात को प्रभावित किया । इस विधि whiteflies के जनसंख्या अध्ययन में सहायता कर सकते हैं, या यदि लिंग आवंटन कुछ पर्यावरणीय उत्तेजनीय के साथ मौजूद है निर्धारित करने में ।

Introduction

लिंग आवंटन का अध्ययन, या पुरुष और महिला वंश में सापेक्ष निवेश, व्यवहार पारिस्थितिकी1,2,3की एक आधारशिला है । व्यवहार के अनुकूली मॉडल के परीक्षण के लिए अपनी शक्ति के अलावा, एक जीव के लिंग आवंटन रणनीति जानने के अपने जनसंख्या गतिशीलता के मॉडल में सुधार हो सकता है । कई प्रजातियों में, लिंग आवंटन माताओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है । लिंग आवंटन का निर्धारण करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि अंडा जमाव के समय प्राथमिक लिंग अनुपात या महिलाओं के अनुपात का निर्धारण करें । हालांकि वयस्क उद्भव में लिंग अनुपात लिंग आवंटन करने के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं, पुरुष और महिला किशोरों के बीच अंतर विकासात्मक मृत्यु आमतौर पर वयस्क लिंग अनुपात काफी तिरछा हो सकता है । Hymenoptera की कुछ प्रजातियों में, कीड़े है कि चींटियों, मधुमक्खियों, और wasps शामिल के आदेश, प्राथमिक लिंग अनुपात सितोगेनिक क assays के साथ निर्धारित किया गया है, भ्रूण आनुवंशिक डीएनए को देखने धुंधला । क्योंकि hymenopterans अगुणित कर रहे हैं, एक प्रारंभिक पुरुष अंडे अगुणित है और केवल मादा उच्चारण (एन) शामिल है, जबकि प्रारंभिक मादा अंडे द्विगुणित कर रहे है और दोनों पुरुष और महिला प्राक्केंद्रक (2n) होते हैं । हालांकि Aleyrodidae, सच कीड़े (Hemiptera) का रस खिला परिवार whiteflies के रूप में जाना जाता है, भी हैपलोद्विगुणित कर रहे हैं, वहां एक स्थापित परख नहीं किया गया है इन कीड़ों में प्राथमिक लिंग अनुपात लगता है । यह शायद इस परिवार में कुछ महानगरीय गंभीर कीट के अध्ययन की तीव्रता दी आश्चर्य की बात है और सफ़ेद मक्खियों के प्रतिस्पर्धी बातचीत में सेक्स अनुपात के महत्व4,5,6,7 ,8,9,10 और जनसंख्या गतिशीलता में आम तौर पर । हेप्लोद्विगुणित कीटों में भी लिंग अनुपात लिंग निर्धारण प्रणाली द्वारा अबाधित होता है, जिससे चयनात्मक निषेचन और लाबाइल लिंग अनुपात की संभावना होती है जो पर्यावरण2के साथ बदलती रहती है । यहां हम एक तकनीक वर्तमान सफ़ेद मक्खियों की प्रजातियों के परिसर के प्राथमिक लिंग अनुपात निर्धारित करने के लिए sweetpotato सफ़ेद मक्खियों, बी tabaci के रूप में जाना जाता है । इस एक प्रजाति का नाम दुनिया भर में 28 से अधिक प्रजातियों में शामिल11और सबसे हानिकारक वैश्विक इनवेसिव कीट12,13में से कुछ शामिल हैं । B. टेबासी और अन्य aleyrodidae में लिंग आवंटन पैटर्न का निर्धारण करने के लिए इस तकनीक के आवेदन चर की एक अधिक कठोर जांच की अनुमति देगा, तापमान सहित, मेजबान संयंत्र, एंडोसहजीवी बैक्टीरिया, या संयंत्र/ रोगाणुओं, कि ह्वाइटफ्लाई प्राथमिक लिंग अनुपात और ह्वाइटफ्लाई जनसंख्या गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं ।

हम बी टेबासीके लिए किसी भी तुलनीय अंडे धुंधला तकनीकों से अनजान हैं । प्रोटोकॉल अंय कीट अंडे14 के लिए इस्तेमाल दाग तरीकों के साथ तुलना में सुविधाजनक है क्योंकि यह एक रातोंरात निर्धारण कदम omits और, इसलिए, 3 एच के भीतर पूरा किया जा सकता है । एक आवेदन का एक उदाहरण के रूप में, एक एंडोसहजीवी जीवाणु, रिक्केट्सिया sp. nr. bellii, हमारे B. टेबासी मध्य पूर्व एशिया माइनर 1 (MEAM1)15,16की प्रयोगशाला लाइनों में महिला पूर्वाग्रह के साथ जुड़ा हुआ है । एक B. टेबासी MEAM1 प्रयोगशाला लाइन में ("MAC1," मैरीकोपा कृषि केंद्र से एकत्र), हम परीक्षण कि रिकेटशियासंक्रमित (आर+) महिलाओं असंक्रमित (आर-) महिलाओं से अधिक अंडे खाद ।

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Protocol

नोट: सुनिश्चित करें कि सभी काम एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में या एक धूआं हुड के नीचे कमरे के तापमान पर किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में सभी ' बूंदें ' ऑपरेटर की पसंद के आधार पर 5-20 μL के रूप में परिभाषित कर रहे हैं ।

1. प्रारंभिक सेटअप

  1. महिला सफ़ेद मक्खियों साफ पत्तियों पर ओविपोस्ट करने की अनुमति दें । ओपोजिशन एरेनस के लिए उदाहरण क्लिप पिंजरों या एक पेट्री डिश में आगर पर फिट करने के लिए कट पत्ते शामिल हैं । क्लिप पिंजरे या पेट्री डिश कवर में एक coverable छेद करने के लिए डालने और वयस्कों को हटा दें । वैकल्पिक रूप से, जल्दी से बर्फ पर एकत्र वयस्कों के एक पोत डाल दिया है, और फिर, उंहें पत्ती पर जमा । अंडे में पैतृक उच्चारण में शुक्राणु संक्रमण की निगरानी सुनिश्चित करने के लिए ६० मिनट से अधिक नहीं करने के लिए ओविपोजिशन और अंडा निर्धारण के बीच समय सीमा.
    नोट: अंडे पत्ती से नहीं हटाया वयस्कता के लिए वयस्क सेक्स अनुपात रिकॉर्ड करने के लिए चांगली हो सकती है ।
  2. पहले या के दौरान ह्वाइटफ्लाई oviposition, यह साबुन और पानी के साथ सफाई से एक माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार है, यह अच्छी तरह से सुखाने, और फिर एक छोर पर पैराफिन फिल्म का एक टुकड़ा खींच, यकीन है कि पैराफिन फिल्म की सतह को तोड़ने नहीं करता है (चित्रा 1) ।
    नोट: पैराफिन फिल्म जलविरागी और अर्द्ध अपारदर्शी है, तरल पदार्थ बूंदों और अंडे बनाने के लिए और अधिक आसानी से देखा जा करने के लिए अनुमति देता है ।

2. विचोरीकरण

  1. एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ, पैराफिन फिल्म के लिए ब्लीच समाधान (०.८३% सोडियम हाइपोक्लोराइट) की बूंदें जोड़ें ।
    नोट: यह अंडे का ट्रैक रखने के लिए आसान है अगर केवल 2-3 अंडे प्रत्येक बूंद में हैं । वैकल्पिक रूप से, एक बड़े अंडे की संख्या का प्रबंधन करने के लिए, 1x फॉस्फेट की बूंदों में अंडे इकट्ठा-buffered खारा (PBS) ।
    चेतावनी: ब्लीच राक है; दस्ताने पहनते है जब ब्लीच हैंडलिंग और श्वास नहीं है ।
  2. वयस्क सफ़ेद मक्खियों पत्ती से निकालें ।
  3. एक खुर्दबीन के नीचे पत्ती प्लेस अंडे स्पष्ट रूप से देखने के लिए और एक पतली जांच के साथ अकेले और ध्यान से अंडे इकट्ठा । एक जांच करने के लिए, ४५ डिग्री पर या एक पिघल पिपेट टिप (चित्रा 2) में एक आरामदायक काम कर कोण पर एक minuten नडेल पिन डालें ।
  4. ब्लीच या 1x PBS के लिए अंडे स्थानांतरण । यदि 1x PBS का उपयोग कर, एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ 1x PBS निकालें एक बार सभी अंडे और एकत्र कर रहे हैं, तो, अंडे के लिए ब्लीच जोड़ें ।
    नोट: जब अंडे का संग्रह, धीरे से अपने आधार से अंडे उठा जब तक पेडिकेल पत्ती से हटा दिया जाता है । पेडिकेल चिपचिपा है, और अंडा आमतौर पर जांच टिप करने के लिए छड़ी जब तक यह ब्लीच में डूबा हुआ है ।
    नोट: यह सभी अभिकर्मकों के लिए अलग गिलास pasteur पिपेट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, और पिपेट गर्मी के साथ संशोधित किया जा सकता है युक्तियों को संकरा बनाने के लिए और गलती से ह्वाइटफ्लाई अंडे aspirating के जोखिम को कम । अवशेषों और संदूषण को रोकने के लिए, प्रत्येक उपयोग के बाद विआयनित पानी के साथ पिपेट साफ ।
  5. 10 मिनट के लिए रुको । यदि 1 ज से अधिक उम्र के अंडों में भ्रूणयोजनजनन में रुचि हो तो अंडे को ब्लीच में 15 मिनट तक छोड़ दें ।
    नोट: अंडे कि 1 एच पुराने, 10 मिनट के लिए कर रहे है के लिए पर्याप्त है ।

3. नियतन

नोट: ये कदम एक Hymenopteran प्रोटोकॉल17से लिया जाता है ।

  1. एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ (चोरियों टुकड़े युक्त) ब्लीच निकालें और इसे त्यागने । एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ ग्लेशियल एसिटिक एसिड की बूंदों जोड़ें और 3 मिनट प्रतीक्षा करें ।
    चेतावनी: एक धूआं हुड के तहत इस कदम के साथ आगे बढ़ें । हिमनदीय एसिटिक अम्ल संक्षारक है; दस्ताने पहनें जब हिमनदीय एसिटिक एसिड हैंडलिंग और श्वास नहीं, विशेष रूप से अवशिष्ट ब्लीच के साथ संयोजन में.
  2. एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ हिमनदों एसिटिक एसिड निकालें और एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ क्लार्क के समाधान (3:1 पूर्ण इथेनॉल के: हिमनदीय एसिटिक एसिड) की बूंदें जोड़ें । रुको जब तक समाधान के सबसे वाष्पित (या 10 मिनट अधिकतम) है ।
  3. एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ अंडे के लिए ७०% इथेनॉल की बूंदें जोड़ें और इथेनॉल के सबसे जब तक इंतज़ार (या 10 मिनट अधिकतम) वाष्पित है ।

4. धुंधला करना

  1. एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल निकालें और एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ अंडे के लिए 1x pbs के बूंदें जोड़ने के लिए ७.० के करीब पीएच मिलता है । एक नमी चैंबर में माइक्रोस्कोप स्लाइड सेट सुखाना रोकने के लिए, उदाहरण के लिए, एक खाली पिपेट टिप बॉक्स में एक गीला कागज तौलिया के साथ अंदर (चित्रा 3) । न्यूनतम 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
    नोट: यह सबसे अच्छा बिंदु अगर एक ठहराव की जरूरत है, जब तक नमी चैंबर सुखाना रोक सकता है ।
  2. एक गिलास Pasteur पिपेट के साथ 1x PBS निकालें, और एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ ०.१ μg/मिलीलीटर DAPI, एक डीएनए फ्लोरोसेंट दाग की बूंदें जोड़ें । एक अंधेरे नमी चैंबर में माइक्रोस्कोप स्लाइड सेट और कम से 15 मिनट रुको ।
    चेतावनी: DAPI एक अड़चन है, तो यह दस्ताने के साथ संभाल ।

5. धुलाई

  1. एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ DAPI निकालें ।
  2. 1x TBST की बूंदें जोड़ें (5x समाधान Tris के 30 जी, NaCl के ४३.८ जी, polysorbate 20 के 5 मिलीलीटर, और नेन3 के १.० ग्राम [पीएच ७.५], और 1 एल को पीसीआर ग्रेड पानी के साथ लाया) एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ अंडे के लिए । एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ 1x TBST हटाने से पहले 5 मिनट रुको । इस चरण को 2 बार दोहराएं ।

6. बढ़ते

  1. अंतिम धोने के बाद, ध्यान से पैराफिन फिल्म से सभी अंडे पिपेट माइक्रोस्कोप स्लाइड के एक साफ हिस्सा पर । अतिरिक्त 1x TBST निकालें; फिर, बढ़ते मीडिया के 20 μL (८०% ग्लिसरॉल और 20% 1x TBST के साथ 2% n-propyl-gallate) जोड़ें और अंडे के शीर्ष पर एक साफ कवर स्लाइड जगह है ।
  2. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर स्लाइड मुहर और फिर, या तो अंधेरे में 2 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान या तुरंत एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे देखने ।

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Representative Results

यह जांचने के लिए कि क्या रिकेट्सिया बीटाबासी MEAM1 महिलाओं की निषेचन दर को प्रभावित करता है, हम रिक्केटशिया-संक्रमित (r+) या असंक्रमित (r-) b. ताबचि पर लोबिया पौधों (vigna unguiculata 27 डिग्री सेल्सियस पर अलग पिंजरों, ७०% सापेक्ष आर्द्रता, और एक 16 एच लाइट/ R+ और r- चौथा instar सफ़ेद मक्खियों ध्यान से पत्तियों से हटा दिया गया और २०० μl पट्टी ट्यूबों में अलग । जब वयस्कों में उभरा, वे ५०% महिलाओं के समूहों में एकत्र किए गए और पेट्री व्यंजन में साफ पत्तियों को हस्तांतरित (n = ~ 50-100/पत्ती) संभोग के 4 दिनों के लिए । लगभग 20 महिलाओं और कई पुरुषों के समूह तो एक साफ पत्ती डिस्क को हस्तांतरित किया गया (आर के लिए एक- वयस्कों, आर+ वयस्कों के लिए एक) ३५ मिमी पेट्री व्यंजन 1% आगर पर आराम में । पेट्री डिश ढक्कन काट दिया गया था और ठीक कपड़े रोकथाम के लिए इस्तेमाल किया जाल भी अतिरिक्त कंडेनसेशन रोका । लगभग ४५ मिनट के बाद, सभी वयस्कों को हटा दिया गया, अंडे के कुछ निषेचन दर निर्धारित करने के लिए काटा गया था, और अंडे है कि एकत्र नहीं किया गया वयस्कता के लिए वयस्क लिंग अनुपात की गणना करने के लिए मागणी कर रहे थे । एक ही दिन के लिए एक पलटन, दोनों आर+ और आर- whiteflies के लिए, एक ब्लॉक के रूप में परिभाषित किया गया था । निषेचन दर या प्राथमिक लिंग अनुपात की गणना के लिए सात ब्लॉक थे, जबकि वयस्क लिंग अनुपात की गणना के लिए छह ब्लॉक थे, क्योंकि एक ब्लॉक से वयस्कता के लिए पीछे के लिए पर्याप्त बचे हुए अंडे नहीं थे । एक सामान्यीकृत रैखिक मॉडल सांख्यिकीय पैकेज R में इस्तेमाल किया गया था निर्धारित करने के लिए कि क्या निषेचन दर या वयस्क लिंग अनुपात काफी Rickettsia संक्रमण से प्रभावित थे और/ प्रतिक्रिया चर निषेचित अंडे/सभी अंडों के अनुपात, या महिला वयस्कों/सभी वयस्कों के अनुपात क्रमशः थे, जबकि व्याख्यात्मक चर ब्लॉक और रिकेट्सिया संक्रमण की स्थिति थे ।

डापी नाभिकीय अभिरंजक द्वारा अपनाई जाने वाली एग डिचोरियों के बाद प्रतिदीप्त सूक्ष्मदर्शी (चित्र 4) के साथ मनाया जाने पर निषेचन (और भ्रूण लिंग) के असंदिग्ध समनुदेशन की अनुमति दी गई । इस प्रयोग के लिए आर-बी टाबासी MEAM1 महिलाओं और ८२ अंडों द्वारा आर+बी द्वारा बिछाई गई ९० अंडों की ताबची MEAM1 महिलाओं ने रन बनाए । के रूप में अंडे के लिए वयस्कता के लिए येते, ६० आर- और ९५ आर+ वयस्कों बनाए गए थे । जबकि वयस्क लिंग अनुपात में एक महिला पूर्वाग्रह लगातार पहले अध्ययन में दिखाया गया है15,18,19, वर्तमान अध्ययन में, वयस्क आर+ लिंग अनुपात (६९% महिलाओं, माध्य) थे महिला-पक्षपातपूर्ण की तुलना में आर - महिलाओं (५०% महिलाओं, माध्य), लेकिन दो उपचार में लिंग अनुपात काफी अलग नहीं थे (χ2 = १.०२, df = 1, p = ०.३१; चित्रा 5) । प्राथमिक R- लिंग अनुपात (६०% निषेचित अंडे, माध्य) थे महिला-पक्षपातपूर्ण की तुलना में r+ लिंग अनुपात (४४% निषेचित अंडे, माध्य) लेकिन यह भी काफी अलग नहीं थे (χ2 = ०.५१, df = 1, p = ०.४७), प्रदान नहीं आर+ महिलाओं द्वारा अधिक से अधिक निषेचन दरों के लिए साक्ष्य (चित्रा 5) । ब्लॉक भी प्राथमिक पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था (χ2 = ०.२९, df = 1, p = ०.५९) या वयस्क (χ2 = १.२०, df = 1, p = ०.२७) लिंग अनुपात ।

Figure 1
चित्रा 1: पैराफिन फिल्म और ब्लीच की बूंदों के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड की तस्वीर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक जांच का एक उदाहरण, गर्मी के साथ फैशन, एक पिपेट टिप और एक minuten nadeln पिन से । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक नमी चैंबर, एक खाली पिपेट टिप बॉक्स और एक गीला कागज तौलिया से जमाने का एक उदाहरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: B. टेबासी अंडे की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवियां । (अ) ब. ताबाचि MEAM1 निषेचित, आरंभी मादा अंडा. (ख) अनिषेचित, आरंभिक नर अंडा । अंडे 1 एच से भी कम पर तय किया गया था और अंडपी के साथ दाग के बाद । प्रत्येक अंडाणु का आधार जीवाणु डीएनए (पोर्टिएरा, हैम्लिटोनेला, और संभवतः रिकेट्सिया) के कारण जीवाणुजनित जीवाणु कोशिका में होता है, जो कि निर्धारित अंडे20,21में शामिल होता है । प्रत्येक अंडा में, मादा उच्चारण अंडे के केंद्र के पास है, और मादा अंडे में ही, शुक्राणु क्या संभवतः एक autofluorescing micropyle के पास अंडे के शीर्ष के पास एक उज्ज्वल लकीर के रूप में दिखाई दे रहा है । छवियों एक जेड से लिया स्क्रीनशॉट-स्टैक उत्पंन वीडियो, एक लेजर स्कैनिंग संनाभि उल्टे माइक्रोस्कोप द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । स्केल सलाखों पिछले माइक्रोस्कोप छवियों से अनुमान लगाया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्राथमिक और वयस्क रिकेट्सियाके लिंग अनुपात-संक्रमित या असंक्रमित B. टेबासी. प्राथमिक लिंग अनुपात (निषेचित अंडों का प्रतिशत, या मादा जाइगोट्स का प्रतिशत) का बॉक्स और व्हिस्कर का भूखंड, ग्रे में वयस्क लिंग अनुपात (वयस्क महिलाओं का प्रतिशत) की तुलना में काले रंग में, रिकेट्सिया-संक्रमित (r+) और असंक्रमित (r -) B. टेबासी MEAM1, "MAC1" जेनेटिक लाईन. बॉक्स और मूंहा भूखंडों मध्य रेखा के रूप में माध्य, एक धन चिह्न के रूप में मतलब है, और ऊपरी और निचले quartiles कि बॉक्स के छोर बनाने लाइनों के रूप में, और रेंज बॉक्स से फैली बाहरी लाइनों में प्रतिनिधित्व किया है दिखा । आर के लिए अंडे रन बनाए: n = ९०; के लिए आर+ अंडे बनाए: n = ८२ । R- वयस्कों के लिए गिना: n = ६०; के लिए R+ गिना वयस्कों: n = ९५ । सांख्यिकीय पैकेज R में किए गए प्राथमिक लिंग अनुपात (निषेचित अंडों का अनुपात) के संभार विश्लेषण में, ब्लॉक के लिए कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पाया गया (n = 7, χ2 = ०.२९, df = 1, p = ०.५९) या रिकेट्सिया के लिए संक्रमण (χ2 = ०.५१, df = 1, p = ०.४७) । वयस्क लिंग अनुपात, ब्लॉक (एन = 6) और रिकेट्सिया संक्रमण की स्थिति से प्रभावित के रूप में, इसी तरह विश्लेषण किया गया । यहां के रूप में अच्छी तरह से, कोई महत्वपूर्ण प्रभाव ब्लॉक के लिए पाए गए (χ2 = १.२०, df = 1, p = ०.२७) या rickettsia संक्रमण के लिए (χ2 = १.०२, df = 1, p = ०.३१) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकोल सबसे पहले B. टेबासीके निषेचन दर या प्राथमिक लिंग अनुपात पर कब्जा करने के लिए है । इस प्रोटोकॉल की चुनौती यह है कि यह सीखने के लिए कैसे ह्वाइटफ्लाई अंडे को जल्दी से संभाल करने के लिए शोधकर्ताओं की आवश्यकता है, यह सुनिश्चित करना है कि अधिक से अधिक नहीं 1 एच के बाद से अंडे जब तक वे तय कर रहे है ओविपोजिटेड थे पारित कर दिया गया है । प्रारंभिक प्रयोगों के दौरान, 3 एच या अधिक postoviposition पर तय किया गया अंडे भी निषेचन का पालन करने के लिए बहुत पुराने थे, के रूप में युग्मक संलयन हुआ था और मिटिक डिवीजनों चल रहे थे. 1 से 3 ज के बीच, pronuclei एक राउंडर आकार पर ले लिया । जबकि दो नाभिक की प्रारंभिक उपस्थिति एक निषेचित अंडा इंगित करता है, एक बिट बाद में, syngamycan के लिए तैयार करने में दो नाभिक की स्थिति एक नाभिक होने के लिए दिखाई देते हैं, और बाद में फिर से, पहली मिटिक विभाजन के दो उत्पादों दोनों पुरुष और मादा अंडे में पाया जाता है । इसलिए, लिंगों के बीच अंतर बाद में इन बिंदुओं पर स्पष्ट नहीं है, और हम एक रूढ़िवादी उपाय के रूप में ओव्पोजिशन से निर्धारण करने के लिए 1 एच के अंतराल सीमित सलाह । यह भी है कि वे गलती से पिपेट में aspirated नहीं कर रहे है तरल के प्रत्येक हस्तांतरण के साथ अंडे के साथ कोमल होना सीखना कैसे चुनौतीपूर्ण है । एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत अंडे को देखने के समय, प्रोटोकॉल के दौरान अंडे के कुछ टूट सकता है, तो उन अंडे sexed नहीं किया जा सकता है और pronuclei और जर्दी के रूप में गिना हो सकता है बच गया । अंयथा, एक बार ऑपरेटर इन चरणों के साथ सहज हो जाता है, प्रोटोकॉल 3 एच के भीतर आसानी से पूरा किया जा सकता है, क्योंकि यह एक रातोंरात निर्धारण कदम की आवश्यकता नहीं है । यह भी है कि यह पुराने अंडे दाग संशोधित किया जा सकता है में लचीला है, उन शोधकर्ताओं के लिए विकास पर कब्जा करने में दिलचस्पी है ।

इस प्रोटोकॉल के एक आवेदन में लिंग आवंटन पर अनुसंधान शामिल है । हालांकि ह्वाइटफ्लाई जीव विज्ञान के अध्ययन के कई दर्जनों अलग वातावरण में वयस्क लिंग अनुपात की सूचना दी है, वयस्क लिंग अनुपात सेक्स के साथ मां के लिंग आवंटन भाड़-nymphs के विशिष्ट विकास की मृत्यु दर और यह असंभव को निर्धारित करने के कारण किसी भी लिंग अनुपात पैटर्न की । सितोगेनिक क तकनीक यहां वर्णित ह्वाइटफ्लाई सेक्स आवंटन पैटर्न और अधिक आम तौर पर समझने की संभावना की अनुमति देता है । जबकि बी टेबासी के बड़े परिक्षेपी आबादी और ऐसे ग्रीनहाउस whitefly के रूप में अंय कीट, trialeurodes वाष्प, 1:1 सेक्स अनुपात में परिणाम की भविष्यवाणी की जा सकती है, के रूप में अक्सर प्रयोगशाला सेटिंग्स में प्रदर्शित22, 23, हम यह भी भविष्यवाणी करते हैं कि प्रजनन हस्तक्षेप, एंडोस्बियोंट और संभावित रूप से मेजबान पादप गुणवत्ता प्राथमिक लिंग अनुपात को प्रभावित कर सकती है । कि ये वही कारक भी विकास के दौरान सेक्स-विशिष्ट मृत्यु के पैटर्न को प्रभावित कर सकते हैं, व्यवस्थित रूप से लिंग अनुपात का अनुमान लगाकर, प्राथमिक लिंग अनुपात के प्रत्यक्ष माप की आवश्यकता को रेखांकित करते हैं ।

जबकि महिला पूर्वाग्रह rickettsia संक्रमण के साथ जुड़े लगातार आनुवंशिक रेखा में पाया गया है "MAC1"15,18,19, वयस्क लिंग अनुपात नहीं थे काफी महिला पक्षपातपूर्ण वर्तमान अध्ययन में । कोशिकानुवंशिकी तकनीक के साथ मनाया प्राथमिक लिंग अनुपात भी काफी पक्षपातपूर्ण नहीं थे. हम सिर्फ 1 दिन पर बी टेबासी महिलाओं के प्राथमिक और वयस्क लिंग अनुपात, एक अंडनिक्षेपण मुक्केबाज़ी, जब महिलाओं 4 से 5 दिन पुराने थे की शुरुआत में, तो लिंग अनुपात का अध्ययन किया है कि हम अब समय पर मनाया सेक्स अनुपात का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है censused । फिर भी, इस तकनीक को निषेचन दर या प्राथमिक लिंग अनुपात का निर्धारण करने के लिए संभव बनाया है और, इस उदाहरण में, प्राथमिक और वयस्क लिंग अनुपात के बीच एक पत्राचार दिखाया ।

निषेचन का निर्धारण भी उदाहरणों में जो शोधकर्ताओं को ह्वाइटफ्लाई आबादी के बीच प्रजनन अलगाव के प्रकार का निर्धारण करना चाहते हो सकता है मूल्यवान हो सकता है । जबकि यह कुछ विवाद की बात हो गई है12,24,25, यह अब आम तौर पर स्वीकार किया है कि नाम बी टेबासी गुप्त प्रजातियों में से एक को संदर्भित करता है, दोनों आनुवंशिक विचलन द्वारा प्रदान की जा रही सबूत के साथ और उन परीक्षणों को पार करना जिसमें कुछ महिलाओं का उत्पादन12,25है । इन अध्ययनों में, यह पता करने के लिए कि अलगाव कहां होता है ब्याज की होगी । शुक्राणु स्थानांतरित है, और विषमविशिष्ट शुक्राणु निषेध अंडे करता है, या असफल करने की कोशिश कर रहे है matings? प्राथमिक लिंग अनुपात के निर्धारण के बारे में, इस तकनीक का निर्धारण कर सकते है कि प्राथमिक लिंग अनुपात endosymbionts, स्वार्थी आनुवंशिक तत्वों, या कई अंय कारकों में से एक से प्रभावित है, conspecifics सहित, प्रतियोगियों, शिकारियों, परजीवी, रोगाणुओं, मेजबान संयंत्र, या अजैविक प्रभाव ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अनुसंधान के लिए एक NSF अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (देब-१०२०४६०) M.S.H. और एक USDA आफरी अनुदान (2010-03752) करने के लिए M.S.H. लेखक बहुत कौशल और जेन के साथ ह्वाइटफ्लाई अंडे धुंधला करने के लिए brennan zehr धंयवाद । लेखक इमेजिंग के लिए अपने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के उपयोग की अनुमति के लिए माइक Riehle धंयवाद । लेखकों ने अंडे की छवियों के लिए सुजान केली और मार्को गेबिओला को धन्यवाद । लेखकों प्रयोगों के दौरान महत्वपूर्ण क्षणों में मदद करने के लिए सुजान केली और जिमी Conway धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Any
1x TBST Any 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water
Bleach Clorox Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite
Clear nail polish Any
DAPI dilactate Santa Cruz Biotechnology sc300415
Ethanol Any Dilute to 70% EtOH
Fluorescent microscope Nikon Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used
Glacial acetic acid Mallinckrodt UN2789
Glycerol Any
Microscope Wild A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used
Microscope slide covers Any Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers.
Microscope slides Any
Minuten nadel pins BioQuip 1208SA Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips
NaCl Any
NaN3 Any
n-propyl-gallate Sigma/Santa Cruz Biotechnology P3130/sc-250794
Parafilm Bemis
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes
PCR grade water Any
Pipette tips Any Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins
Small dropper bulb Any Must fit on Pasteur pipette
Tris Any
Tween-20 Any

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References

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जेनेटिक्स अंक १४६ बेमिसिया टैबसी लिंग आवंटन प्राथमिक लिंग अनुपात निषेचन दर साइटोजेनेटिक्स dapi
एक कोशिका आनुवंशिक तकनीक का उपयोग कर <em>बेमिसिया टैबची</em> के अंडे निषेचन दर का निर्धारण
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Bondy, E. C., Hunter, M. S.… More

Bondy, E. C., Hunter, M. S. Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique. J. Vis. Exp. (146), e59213, doi:10.3791/59213 (2019).

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