Summary
免疫組織化学、西部の分析、および RNA 抽出のための組織の処理のためのプロトコル、ショウジョウバエ蛹網膜を解剖するための手術方法を提案する.
Abstract
ショウジョウバエ蛹網膜は、開発中に地形形成過程の研究のためのエクセレント モデル システムを提供します。繊細なショウジョウバエ蛹網膜の解剖のための信頼性の高いプロトコルを提案します。私たちの外科的アプローチは、蛹を開き目脳錯体を正確に抽出するすぐに利用できるレーザーマイクロダイ セクション ツールを利用しています。これら固定、免疫組織化学と網膜を受けるし、顕微鏡スライド上にマウントでき、目標は細胞または細胞レベル下の構造を検出する場合をイメージします。また、固定されていない網膜脳組織から分離された、適切なバッファーで分離でき (それぞれ、タンパク質や遺伝子の発現を評価する) の蛋白質のゲル電気泳動や mRNA の抽出のために利用します。重要な練習と忍耐、レーザーマイクロダイ セクション プロトコルを習得する必要がありますが、プロトコルにより主に破損していない網膜の比較的簡単な分離、一度マスター。
Introduction
ショウジョウバエ網膜は、ハニカム格子1,2,3,4に配置された色素細胞に囲まれた約 750 個ので構成されます。各 ommatidium には、8 つの光受容器ニューロン、レンズ分泌 4 つの錐体細胞、2 つの主な色素細胞が含まれています。各 ommatidium の周辺には、格子の色素生産細胞、感覚毛のグループ。分裂の性質などステレオタイプの六角形配置によりショウジョウバエ蛹網膜は細胞接着5,6を含む地形形成過程の研究のためエクセレント モデル システムを提供します。 7,8,9,10とアポトーシス11,12,13,14,15。
いくつかの公開されているプロトコルはショウジョウバエ蛹16,17,18から目脳錯体を抽出する空気の圧力を利用します。説明されたプロトコルはここで代わりに慎重にレーザーマイクロダイ セクション ツールを利用し、破損していない網膜組織を得ることが目標と目脳錯体を正確に分離します。これは重要なために利用する場合は網膜形態、タンパク質や遺伝子発現解析網膜への損傷は、細胞ストレスまたは死は、細胞の表現型および遺伝子発現を変更で起因できるので。さらに、10 〜 15 分、年齢と切り裂かれた眼組織の発達段階の変動を最小限に抑えるという目標を促進することで、練習後、6 に 10 目脳錯体を分離できます。
固定、染色、および下記全体マウント プロトコル、ショウジョウバエの目の蛍光顕微鏡検査のための準備に適しています。網膜は、抗体は興味の蛋白質をターゲットに培養することができます。たとえば、単接合部品に抗体を活用して、細胞の頂端の外周を可視化できるようにセルの種類を含む特性、形状と配置評価19ことできます。、固定する前に目は西部の分析のための蛋白質または qRT PCR 用 RNA、RNA シーケンスを抽出するための脳から代わりに切断することができます。
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Protocol
1. ティッシュの準備
- ショウジョウバエを設定 (前述20) を越える目的の遺伝子型の蛹を取得する特定のショウジョウバエ系統の文化や。確保するため、多数の蛹が偶然出てくる、栄養豊富な食品メディアまたは寛大酵母ペーストを添加した標準的な食品メディア複製でこれらのフライの文化を確立します。
- 25 ° C でのショウジョウバエの文化を維持します。UA GAL4 システム利用の十字、 GMR GAL4は幼虫目ディスク細胞形成の溝と蛹の発育21,22,23,後部で理想的なドライバー24. クロスUAS lacZ X GMR GAL4理想的なコントロールとしてクロスそれドライブ非内因性と不活性の β-ガラクトシダーゼ蛋白質の表現として。
- ウェット蒸留水優しく健全な文化バイアル (図 1 a) の側から白い前蛹 (図 1 b) を持ち上げ、1.5 mL 容マイクロ チューブ (図 1) に配置されている 6"竹スプリントのヒントを使用します。
- 室に乾燥 (図 1) から蛹を保護するために十分な湿度を維持するために蒸留水に浸したティッシュの小さい部分と共にプラスチック ピペット チップ ボックスにチューブを配置します。25 ° C で蛹を解剖までインキュベートします。
- 遠心チューブからと解剖皿黒に蛹を優しくプッシュするのに乾燥 6"竹の添え木を使用します。蛹から解剖皿の上に両面テープの新鮮な作品を置きます。
- テープ (図 2 a) の上に (すなわち、operculums 上向き、図 1 b) を蛹の背側を置く慎重にピンセットのペアを使用して。蛹がテープによく付着することを確認します。
注: 蛹の場合水分がテープを安全な接着を阻害する場合、両面テープの上に置く前に空気乾燥に蛹を許可します。
2. 目脳錯体の解離
- 鉗子を使って、各の蛹 (図 2) の蓋を外します。
- 顕微解剖はさみを使用して、スライスまたは各蛹の蛹のケースを開いてカットします。フラップは、頭、胸部、両面テープ (図 2) に蛹のケースの縁を保護前方の腹部のセグメントを明らかに蛹のケースを開けます。
注: 完全蛹を明らかにする必要はありません。 - 動物を把握するための鋭い鉗子で各蛹の腹部を刺し、その蛹の場合 (図 2) から取り外します。
- テープからの黒い解剖皿の上に蛹を置くし、冷たいリン酸バッファー-ソリューション (PBS、pH 7.4) の約 400 μ L でカバーします。
- 鉗子と顕微解剖はさみ腹部つかんで各蛹、蛹を半分に切断、胸部を切り取り、きれいな断面を作る (図 2 D)。
- PBS から各枝肉の後部の残骸を削除し、解剖皿の上の 1 つの側面に置く (3.2.1 の手順を参照してください、破棄しないでください)。
- 微細鉗子の 2 つのペアを使用して、胸郭と目脳複合体 (図 2 e) を明らかにするそれぞれの蛹の頭を開きます。これを行うには、胸郭の上皮のカット面をつかみ、徐々 に胸部を開き、目脳の複雑な周囲の脂肪組織を公開するカプセルを頭に涙します。
- 組織を把握せずヘッド カプセルの残党から目脳コンプレックスを案内したり、破れたオープン ヘッド カプセルから目脳コンプレックスをスクープ鉗子を使用します。
注: 目脳コンプレックスはダンベル形、オフホワイト、および周囲のクリーム色の脂肪 (図 2 b, E) よりもっと半透明。 - 鉗子、眼組織に触れることがなく目脳錯体に関連付けられているほとんどの脂肪を慎重に取り外します。
3. 蛍光抗体法により組織の処理
- 説明されている (手順 2.1 2.9) として、少なくとも 6-10 蛹を解剖します。
注: 各郭清の 3 ~ 4 独立した複製は、仮説をテストするための十分なデータを生成する傾向があります。 -
洗濯と固定
- P20 の先端または半径 〜 1 mm 先端開口を高め、PBS と上下脂肪のミックスをピペッティングによる潤滑にきれいなかみそりの刃と P100 ピペット チップを切り取ります。この脂肪は、2.6 の手順で削除された枝肉の残党から入手できます。
- ~ 400 μ L の PBS の 9 よくガラス皿に、氷の上に目脳錯体を転送します。潤滑のヒントと P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットを使用して転送します。
注: 目脳錯体がピペッティング中無潤滑のヒントに従うとする破損または紛失しました。 - 目脳複合体を軽く旋回、上下に PBS をピペッティングによる眼組織に関連付けられている残りの脂肪を除去します。これとすべての後続の洗浄のステップではない直接ピペット上下目脳錯体これは壊れやすい眼組織に損傷を与えるよう。
- 最小限のボリュームで目脳錯体 (< 20 μ L) に定着剤の少なくとも 250 μ L の PBS の。上下にソリューションをピペッティングで混ぜます。氷の上の 35 分間インキュベートします。
注: 3.1.1 準備した同じ潤滑のヒントは、この転送する使用できます。 - 同じピペット チップも含む ~ 400 μ L の PBS に目脳錯体を転送します。ソリューションを上下にピペッティングで混ぜるし、を洗う、氷の上の 5-10 分間インキュベートします。少なくとも 2 回洗浄のステップを繰り返します。
メモ: 最終的な PBS 洗浄、4 ° C、3.3.1 の手順に進む前に、氷の上で数時間目脳錯体を維持できます。
-
抗体の汚損
- 抗体ソリューションへの暴露の前に組織をブロックするには、PBT の ~ 400 μ L に目脳錯体を転送します。転送のため潤滑のヒントと P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットを使用します。氷の上の 10 ~ 60 分間インキュベートします。
- PBT で適切な抗体を希釈して一次抗体溶液を準備します。目脳複合体抗体溶解液の 10 μ L の因数で孵化する、ので、準備量は 10 の複製になります。
- 72 よくマイクロウェル トレイのきれいなウェルに抗体溶解液の 10 μ L 分注 (ディスカッションを参照してください)。
- 半径 ~0.5 mm 先端開口上下ピペッティング PBT で注油してきれいなかみそりの刃で P10 ピペット チップの先端をカットします。
- ボリュームで、5 以上の目脳錯体 < P10 空気変位マイクロ ピペットと潤滑のヒントを使用して抗体溶液の各 10 μ L に 3 μ L の PBS。
- 上下にソリューションをピペッティングによる抗体溶液を均質化します。これは組織を損傷するために、上下目脳錯体のピペットないです。
- 抗体溶液の蒸発を抑えるマイクロウェル トレイに蒸留水に浸した組織の小片を置くし、(例えばで提供されるふた) トレイを封印します。4 ° C で一晩インキュベートします。
- マイクロウェル トレイから洗浄する 9 流したガラス皿に PBT の ~ 400 μ L に目脳錯体を転送します。(準備手順 3.3.4) P10 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを使用します。上下にソリューションをピペッティングで混ぜます。氷の上の 5-10 分間インキュベートします。
- 少なくとも 2 回洗浄のステップを繰り返します。P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを使用して、洗浄溶液間目脳錯体を転送します。
- 適切なタグ付きの fluorophore 二次抗体 PBT で必要に応じて希釈することによって二次抗体溶液を準備します。二次抗体溶液を 100 μ l 添加は 6-10 蛹のバッチごとで十分です。因数 9 流したガラス解剖皿に二次抗体の解決。
- 二次抗体の解決に目脳錯体を転送します。P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを転送に使用します。
- 二次抗体溶液室温で 1-2 時間または 4 ° C で 3-5 h 目脳錯体を孵化させなさい光による蛍光物質の漂白を防ぐため、箔と準備をカバーします。
注: 最適な二次抗体溶液中の潜伏期間は使用される第一次および二次抗体によると異なる場合があります。 - 9 よくガラスの皿を洗うの PBT の ~ 400 μ L に目脳錯体を転送します。上下にソリューションをピペッティングで混ぜます。氷の上の 5-10 分間インキュベートします。この洗浄工程は、少なくとも 2 回繰り返す必要があります。
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二次固定
- 二次固定用定着剤の少なくとも 200 μ L に移動目脳錯体と 20 分室温でまたは 4 ° C で 35 分間インキュベート
注: 二次固定取付 (ステップ 3.5) の補助眼組織を硬直します。 - 9 よくガラス皿、氷の上で 5 分間洗浄するのに PBT の ~ 400 μ L に移動目脳錯体に P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを使用します。
- 少なくとも一度洗浄手順を繰り返します。
- 9 よくガラス皿、氷の上で 1-2 分間洗浄する PBS の ~ 400 μ L に目脳錯体を転送するためのヒントの pbt 樹脂潤滑や P100 空気変位マイクロ ピペット使用、P20 維持ピペッティング PBS による運動の組織は組織ではないです。、上下目脳体沈降と PBS リンスの中にガラスの皿に付着を防ぐために。
- 二次固定用定着剤の少なくとも 200 μ L に移動目脳錯体と 20 分室温でまたは 4 ° C で 35 分間インキュベート
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取付
- メディアのマウントの 〜 200 μ L に目脳錯体を転送します。目脳錯体に P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを使用します。1-2 時間のメディアのマウントで平衡に組織を許可します。
- きれいな顕微鏡スライド上に新鮮なマウント メディアの 5-8 μ L のドロップを配置します。
- ~0.5 mm、半径に先端開口を増加し、これと P10 空気変位マイクロ ピペットを使用して、スライドにメディアをマウントのドロップにメディアのマウントの 5-8 μ L で目脳錯体きれいなかみそりの刃で P10 の先端をカットします。
- 視葉から目を分離するのに 2 つのタングステンの針を使用します。丈夫なタングステン針でスライドに目脳複合体をピンし、細かいタングステン針 (図 2 f) でその関連付けられた視葉からそれぞれの目をスライスします。
- スライドに隣接するそれぞれの目の基底面の顕微鏡スライドの表面にそれぞれの目を操縦するためには、細かいタングステン針を使用します。優しくティッシュの上クリーン カバー スリップを下、マニキュアで固定します。
注: は、互いに近接または行にので、スライドに目を配置することその後顕微鏡容易になります。 - 蛍光灯や共焦点顕微鏡を用いた網膜をイメージします。
注: スライドする必要があります 4 ° C で保存されないイメージをすぐに作成します。
4. ウェスタンブロッティング用眼組織の準備:
- 10-16 蛹 (手順 2.1 2.9) 以下の変更を分析: a) 収集と 2 つのバッチは、10-15 分間隔で蛹を解剖し、b) PBS (PBS + pi) ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤を添加したで解剖。
- 移動、P20 を使用して目脳錯体化や空気の変位マイクロ ピペット P100 ~ 400 μ L の PBS + pi 9 よくガラス皿、氷の上で簡単にリンスするに (3.2.1 の手順と準備) の先端を潤滑
注: この潤滑のヒントは、4.3 や 4.4 以降の手順使用できます。 - リンスの手順を 2 回繰り返します。
- 氷冷 PBS + きれいな黒解剖皿の上にデカント pi の ~ 400 μ L にすべて目脳錯体を転送します。
- 丈夫なタングステン針を使用して (目脳複合体を安定させる) する視葉からそれぞれの目を削除して罰金のかみそりの刃や顕微解剖はさみきれいにカットするそれぞれの目視葉から。
注: 目がこの段階で '付箋' と解離性の皿に軽く付着可能性があります。(説明参照) 視葉から目の除去を容易に助けることができる、これは便利です。 - '掃引' すべての目 '山' に PBS + 鉗子の罰金ペアの 1 つのブレードを使用して解剖皿の上の pi。
- P10 の先端半径 ~0.5 mm 先端開口を広げるヒント インテリア ピペッティング ウエスタン組織換散バッファー (WTLB) によってを上下に注油してきれいなかみそりの刃をカットします。
- 500 μ L の微量遠心チューブに 5 μ L の PBS + pi の目脳錯体を転送します。転送を完了するのにこの潤滑ヒントと P10 空気変位マイクロ ピペットを使用します。
- 遠心チューブを氷を場所します。サンプルに WTLB と 2 x 集中蛋白質のサンプルバッファーの 10 μ L (または 5 x 高濃度タンパク質サンプルのバッファーの 2.5 μ L) の 1 ボリューム (5 μ L) を追加します。タップしてミックスします。
- 渦、遠心は簡単にチューブし、デスクトップ小型遠心分離機を使用してサンプルをスピンします。
- 分析までには、-20 ° C でサンプルを格納します。標準的なプロトコルを使用して分析します。
5. に備えて眼組織の RNA の抽出:
- 手袋、クリーン ベンチ、顕微鏡、解剖ツール、および 70% エタノール、RNase 除去試薬と皿をまず解剖黒身に着けています。乾燥することができます。
- 説明されている (手順 2.1 2.9) 以下の変更として 30 40 蛹を解剖:) を収集し、バッチ、15 〜 20 分離れて; 6 に 8 蛹を解剖b) 無料のヌクレアーゼ PBS、c で解剖) 目の各バッチを個別に分離しますが、同じ遠心チューブ (ステップ 5.5) にすべての網膜組織を蓄積します。
注: 同時に解剖 2 人を持っていることは、良い眼組織の効率的な分離を加速させます。 - 各バッチの目脳錯体 (手順 2.1 2.9) と P20 または P100 空気変位マイクロ ピペット、潤滑のヒント (3.1.2 の手順で説明されているように準備) 使用して ~ 400 μ L の氷の上を簡単に洗浄する 9 よくガラス皿のヌクレアーゼ フリーの PBS に転送を分離します。
注: この潤滑のヒントは、5.4、5.5、および 5.8 以降の手順使用できます。 - リンスの手順を 2 回繰り返します。
- ヌクレアーゼ フリーの氷冷 PBS の新鮮な 400 μ L ドロップに解剖料理きれいな黒目脳錯体を転送します。
- (複雑な目脳を安定した) に丈夫なタングステン針を用いて視葉からそれぞれの目を削除して罰金のかみそりの刃や顕微解剖はさみきれいにカットするそれぞれの目視葉から。
注: 目がこの段階で '付箋' と解離性の皿に軽く付着可能性があります。(説明参照) 視葉から目の除去を容易に助けることができる、これは便利です。 - '掃引' すべての目 '山' に鉗子の罰金ペアの 1 つのブレードを使用して解剖皿の上ヌクレアーゼ フリーの PBS の。
- 生殖不能の RNase フリーの遠心管に目を転送し、液体窒素で急速凍結。
- 蛹の各バッチの解離 (ステップ 5.3 5.8) を繰り返します。1 つの管ですべての目を蓄積する液体窒素 (ステップ 5.5) で維持されている同じ遠心チューブに目の各バッチを転送します。
- RNA の抽出まで-80 ° c のサンプルを格納します。
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Representative Results
蛹の目は、そのドライブ形態の発達過程を調査するためのエクセレント モデルとして機能する簡単にアクセスできる組織です。ここで、私たちは網膜を解剖したが、頂アドヘレンスジャンクション (図 3 a, C) またはアポトーシス (図 3)25時にアクティブが Dcp 1 カスパーゼ (図 3 D) を検出する蛍光を使用します。明らかに募集と (18 h APF) から初代培養細胞の形態形成などを含む主要な形成プロセスの中に細胞を観察することがこれらのアプローチ、格子のインターカレーション細胞それぞれの ommatidium (18-24 h APF) 周りの確立、第三紀ニッチ (21-24 h APF) は、セル サイズと形状 (18 h から 40 h APF)、アポトーシス (18 〜 33 h APF) から変更します。これらの形成のイベントのタイミングは温度に依存しが異なります控えめインキュベーター異なる研究室の設定温度のマイナーな違いに対応。しかし、約 40 h APF、セルの最終的な配置は通常達成 (図 3 b、 C) やこの遺伝の突然変異の結果を評価する際に、理想的な年齢は、遺伝子発現を変更します。Diap1、アポトーシス カスパーゼ活性化 (図 3)26のコア阻害剤、我々 のアプローチの次の異所性発現可能コントロールgmr 素子と比較した場合の格子細胞数の増加を定量化するたとえば、> lacZ網膜。1 つはまた、簡単に反 Dcp 1 抗体または (図 3 D) 死細胞を検出する他の方法を用いてより直接アポトーシスを評価できます。
ライセートの目は、プレゼンスおよび興味の蛋白質の相対的な表現の決定する西部の分析を使用して尋問することができます。ここでは、デ-カドヘリンの検出を示す野生型カントン S網膜でアドヘレンスジャンクションのコア コンポーネントを解剖した 21 と 40 h APF (図 4 a) の目。このサンプルの西部のしみの定量化 (右、図 4 a) デ-カドヘリンの相対的な表現が、これら 2 つの時点で、GAPDH (コアの式に従ってバンド強度を正規化するとき大幅に差なかったことを明らかにしました。代謝酵素)。ここで示すように、そのそのような分析も帳票ではなく、ただ一度で通常実行されます。
高度なシーケンス アプリケーション (次世代、RNA シーケンスなど) を使用して遺伝子発現を解析する場合は 1 つの目的にショウジョウバエ蛹網膜から純度の高い mRNA を分離することが欠かせません。我々 は遺伝子型または実験条件ごとの以上 60 の目の解剖が 1 つの目標を分離する場合に最適な発見した > 高品質 RNA (図 4 b) の 1 mg。40 h APF (図 4 b、上部パネル) で解剖、57 の野生型カントン S目から分離された RNA サンプルの吸光度スペクトルの例を示します。ピーク吸光度 260 nm は RNA の吸収波長に対応します。RNA の収穫と A260/A280 と 21 h、40 h APF 収集される六つの RNA サンプルの A260/A230 純度比率を反映したテーブルを提案します。これらのデータは、RNA の微妙な違いをもたらす RNA を抽出するときを反映します。
図 1: 選択および郭清の蛹の文化します。(A) 幼虫と蛹健康ショウジョウバエ文化の側面に沿って検索 3 幼虫 (L3) を徘徊します。(B) 前蛹は、色素はまだ蛹の保護ケースに生成すると、半透明の白い色によって識別できます。蛹の前後と背腹軸は青で示されます。湿った竹林を取り除くし、バイアル壁から前蛹を選ぶため。(C) 蛹は、適切にラベル付けされる 1.5 mL 遠心チューブ内に配置 (遺伝子型、コレクションのコレクションの日付と時刻)、(D) の養殖加湿チャンバー空ピペット チップ ボックスから組み立て中。湿度は濡らしたティッシュのボックス内に配置することによって維持されます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 蛹の目を解剖します。(A) 蛹を解剖皿黒の両面テープに従います。前方、後方、および背側の座標は青色で示されます。(B) 目脳錯体 (単一の 1 つを次に示します)、蛹 (C) を分離するためまず、その蛹のケースから削除されます。このプロセスの重要な手順が表示されます。赤い線は、涙と、蓋が削除された後に蛹のケースを開く位置を示します。蛹は、鉗子で引き裂かれた蛹ケースから削除されます。(D) 露出蛹は最初、顕微解剖はさみ (赤い破線で示されている位置) とヘッド上皮、慎重に破れている (赤矢印)、不透明な目脳複合体を明らかにする (E) のように、胸郭に沿って切断されます。(F) 次の適切な抗体の孵化、網膜は目脳錯体からスライスされます。このプロセスの重要な手順が表示されます。目脳 (左) 丈夫なタングステン針で安定した、高級タングステン針 (右) と網膜が削除されます。タンパク質と RNA 解析、取りはずされた網膜が細かいタングステン針ではなく、細かいかみそりの刃や顕微解剖はさみを使って視葉からきれいにカットできます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 蛹の目の蛍光します。(A) 抗体・ デ ・ カドヘリン ラベル頂アドヘレンスジャンクション蛹の目の細胞の。パネル A のすべての画像は、画像処理ソフトウェアを最低限に変更される、共焦点顕微鏡を用いた網膜の中央部に集められたし、同じ縮尺で表示されます (スケールバー = 5 μ m)。成長と 27 h APF 18 h APF からの細胞の再配置に注意してください。(B) 40 h (左) APF で単一完全パターン ommatidium の断面 ommatidium アプロチの漫画。細胞の種類はキーに記載されている色分けされ。光受容体は多 neuroepithlium の表面の下に埋葬、コーンと色素細胞に囲まれています。毛の 3 つのグループは、各 ommatidium を囲みます。(C) lacZを発現していた (左) またはDiap1 (右) 二次、三次の色素細胞のアポトーシスを抑制する制御網膜の小さな領域。アドヘレンスジャンクション アンチ ・ デ ・ カドヘリンとの標識細胞数、配列、および図形の解析が可能。 にします。画像は、標準的な蛍光顕微鏡を用いた捕獲されました。(抗体培養 D) 全体の網膜は、Dcp-1、アポトーシス、プルーンの目から多数の細胞の中に活性化カスパーゼを活性化。画像は、共焦点顕微鏡を用いた捕獲されました。白い点線は、目をについて説明します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 蛹の目のタンパク質と遺伝子の発現解析します。抗体を用いて探る 28 目 21 h APF または 40 h APF で解剖の (A) 西部のしみ (左) 解消 cad へと、GAPDH ローディング コントロールとして。(右) 蛋白質バンド強度の解析では、匹敵する濃度解消 cad GAPDH に対する網膜のこれらのグループに存在を明らかにします。カントン S 網膜から抽出した RNA サンプルの (B) 単一の吸光度スペクトルを 40 h APF (top) で解剖しました。注吸光度ピーク 260 nm。表 21 と 40 h APF (下) で分離されたカントン S 蛹網膜から抽出した RNA の量と純度の比を文書化します。これらのデータは、3 つの独立したサンプル セットから発生します。各サンプル セットの蛹が発生し同じ条件で培養し、同じ日に解剖。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明したショウジョウバエ蛹目郭清法 10 〜 15 分以内 6 に 10 目脳錯体の分離できます。しかし、忍耐と実践は、解剖テクニックをマスターし、品質と解離の速度を向上させるために不可欠です。今回は短い郭清によりそれぞれの目が約同じ発達段階、データ セット内の網膜の式表現型あるいは遺伝子の可変性を減らすこと。我々 のプロトコルを念入り涙やシャーリング、目への損傷が応力経路の活性化を誘導したりもできるためのリスクを最小限に抑えながら繊細な網膜組織を分離するため代替プロトコルは、マスターの少ない練習を必要があります、しながら細胞死。初心者最初のマスター 40 h APF に若い目を解剖する前に培養した蛹の郭清にお勧めします。あることを確認常に十分な蛹コレクション (手順 1.3) で使用できるすべての実験 (ステップ 1.1) の交差する複製の設定をお勧めします。網膜は、研究者に関心の明確な形態形成イベントによって、蛹の発育中に縦長の様々 で解剖することができます。これらは募集とアポトーシス (18 〜 33 h APF) から、セル サイズと形状 (18 h から 40 h APF) に変更 (21-24 h APF) の第三紀のニッチの確立 (18-24 h APF) 格子細胞のインターカレーション (18 h APF) から初代培養細胞の形態形成を含めることができます。 (図 3 a)。
蛹の場合 (ステップ図 22.2) の初期オープニング中にさなぎの胸部に穴を開けます、研究者は郭清を続行することができるはずです。しかし、頭がパンクした当初場合破損していない目脳錯体を抽出難しいかもしれません。ケース (2.3,図 2、右パネルのステップ)、蛹から蛹を削除するとき腹部の蛹のケースは時々 両面テープから降りるし、蛹の腹部についてラップのままできます。これがそう邪魔に蛹の場合は蛹 (ステップ 2.6) から切り離された蛹が腹部まで PBS で囲まれており、接続されているときに浮かぶかもしれないが。網膜組織の整合性を維持するために、固定または蛹初期穿刺後できるだけ早く冷凍が不可欠です。さらに、冷たいソリューションを使用して、プロトコル全体可能な組織とより良い蛍光抗体法につながる細胞の完全性が保持されますどこにも氷の上 (または 4 ° c) の組織を維持するタンパク質解析または RNA 解析。後者の用途では、脳のすべてを削除することが重要だし、目をこれらの組織から脂肪組織の解析 (ステップ 2.9 や 4.3 5.4) を汚染します。
蛹目脳複合体に付着できる無潤滑ピペット チップ、ガラスおよび郭清ツール固定されていないときまたは PBS 洗浄/リンス組織の損傷に 。これを防ぐためには、お勧めしますピペット チップおよびエタノール 9 よくガラス皿を洗いの細心の潤滑 (洗剤を避けるも必要があります)。代わりに、単に蒸留 H2O が付いているガラス皿をきれいにし潤滑、PBT リンス使用前に必要な場合。剥離鉗子、はさみや針も主にで洗浄してください蒸留 H2O を除いて RNA 抽出解剖 (ステップ 5.1) のためにこれらを準備するとき。ただし、網膜とガラス顕微鏡スライド ライト接着は目を広げるわ、スライドに配置 (ステップ 3.5.4 と 3.5.5) のマウント中に視葉から目を分離するときに役立ちます。同様に、平らにする料理を切り裂く黒目の光接着を使用ことができ、非常に軽くストレッチ網膜のタンパク質や RNA を隔離するとき目視葉接続のきれいな切断を容易にする組織分析 (4.5、5.6 のステップ)。顕微解剖はさみまたは罰金かみそりの刃が迅速かつ明確に視葉から取りはずされた目を切断する優れたツールであることを発見しました。
一次抗体の汚損、中に 72 もマイクロもトレイにセット (ステップ 3.3.5) 目脳錯体の培養ではなく 9 よくガラス皿代わりに使用できます。一晩抗体溶液の蒸発を防ぐため、必ずキャップ カバー スリップやスライド ガラス皿井戸。しかし、このアプローチは、72 もマイクロもトレイの 2 井戸間分散一次抗体溶液 20 μ L ではなく、バッチ培養 1 も 9 もガラス皿の 6-10 目脳錯体の一次抗体溶液の 40-50 μ L が要求されます。
視葉から目を切断する簡単だ、目がフォールドまたは解剖針に付着しにくくなるよう、二次固定目脳錯体 (ステップ 3.4) 顕微鏡のスライド (ステップ 3.5) 目をマウントする前に組織を固めるわずか。メディアをマウント (ステップ 3.5.1) で 1-2 時間培養後目脳錯体となってわずかに不透明なそれゆえ見やすく取り付けしながらします。さらに、メディアをマウントで 1-2 時間後適当に写真漂白蛍光イメージング中からほとんど二次抗体が保護します。これにより網膜、ソフト マウントは推奨されません前にメディアをマウントで一晩網膜をインキュベート、二次固定の補剛効果を否定すること。
西部の分析のため、少なくとも 20 目のライセートがショウジョウバエ蛋白質 (例えば、図 4 a) を確実に認識する抗体を用いたタンパク質が確実に検出に必要です。ただし、興味のターゲット蛋白質の発現は低下がある場合目の大きい数が必要になる場合があります。WTLB のサンプルに追加のボリュームが若干増やすことができますその後西部のしみのための組織の溶解が不完全な (ステップ 4.7) の場合、集中してサンプル バッファー調整 (ステップ 4.9) のボリューム。RNA 抽出のための目のかなりの数の急速な解離必要があります大量の高品質 RNA を分離する場合は目標 (ステップ 5.2、図 4 bを参照してください)。ショウジョウバエ蛹目郭清術をマスターしている 2 つの科学者のコラボレーション フライ網膜のこれらの多数を同時に分析する場合は、この潜在的な欠点を克服できます。ただし、必要な RNA の総額によって異なりますの施設あるいは rna、RNA の解析や、シーケンスの種類を実行する設備の要件と使用される RNA 抽出キット。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
原稿には、ザック ドラムと有用なコメントのための我々 のレビューをありがとうございます。この作品は、R15GM114729 によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
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