Summary
泛化是一种翻译后修饰,在细胞过程中起着重要作用,并且通过二足化进行紧密协调。两种反应的缺陷是人体疾病的基础。我们提供使用纯化成分在体外进行泛化和二次脱体反应的协议。
Abstract
泛化是一种翻译后修饰,在各种信号通路中起着重要作用,并特别参与染色质功能和DNA相关过程的协调。这种修饰涉及几种酶的连续作用,包括E1泛基质激活、E2泛基丁结合和E3泛基质-结合酶,由二苯基苯甲醚逆转。泛化诱导蛋白质降解或蛋白质功能改变,包括酶活性调节、蛋白质-蛋白质相互作用和亚细胞定位。证明蛋白质泛化或二丁基化的关键步骤是使用纯化成分进行体外反应。有效的泛化和二次成位反应可能受到所使用的不同成分、酶共因子、缓冲条件和基质性质的影响。 在这里,我们提供用于进行泛化和二分化反应的分步协议。我们使用小鼠聚孔抑制复合物1(PRC1)、BMI1和RING1B(一种E3泛基质结合酶)的最小成分来说明这些反应,这种酶在119上具有单体蛋白H2A的一元组蛋白H2A。核糖体H2A的二次分体化是使用由人类二苯基辛酶BAP1和DEUbiquitinase ADaptor(DEUBAD)共同因子ASXL2的最小聚氨酯抑制双基酶(PR-DUB)复合物进行的。这些泛化/二氧化化测定可以在重组核小体与细菌纯化蛋白质重组或从哺乳动物细胞中纯化的原生核小体进行。我们强调能够对这些反应产生重大影响的复杂性,我们建议这些协议的一般原则可以迅速适应其他E3泛基苯丙酸酶和二苯基酶。
Introduction
泛化是最保守的翻译后修饰之一,对包括酵母、植物和脊椎动物在内的各种生物体至关重要。泛化包括泛黄蛋白的共价附着,一种高度保守的76个氨基酸多肽,以靶向蛋白质,并发生在三个连续步骤中,涉及三种酶,即E1-激活、E2-结合和E3联苯1, 2,3.这种翻译后修饰在广泛的生物过程中起着核心作用。事实上,提供反应特异性的E3利气,构成一个超级酶系,是泛性酶系统4、5、6中最丰富的酶。蛋白质泛化的下游影响取决于修饰的性质:单体化、多单体化以及线性或分枝多聚体化。单体基质化很少与蛋白酶体降解相关,但这种修饰涉及调解各种信号事件。多聚体化涉及泛基体分子本身中的N-端或赖塞林残留物,而多聚基蛋白的命运取决于泛化蛋白链延伸中涉及的残留物。人们早就知道,由流酶48的泛性基质介导的多聚体化诱导蛋白酶降解。相反,通过无物的以酶63进行多聚体化通常与蛋白质活化7、8、9相关。与其他重要的转化后修饰类似,泛化是可逆的,从蛋白质中去除泛化物通过称为二苯基苯酶(DUBs)的特定蛋白酶得到保证,这些蛋白酶已成为细胞过程的重要调节器2,10.重要的是,许多DUB是高度专业化的,并通过二次基质调节特定的基质,表明在泛化与二苯基化之间的良好平衡对蛋白质功能至关重要。E3s 和 DUB,以及蛋白酶体降解机制和附件因素,形成泛素蛋白酶体系统(UPS,具有 >1200 基因),用于调节主要信号通路,其中几个与细胞生长和增殖相关,细胞命运决定、分化、细胞迁移和细胞死亡。重要的是,放松管制的几个信号级联涉及泛化促进肿瘤发生和神经退化疾病5,11,12,13,14.
泛化在染色质生物学和DNA依赖过程15、16、17中起着普遍作用。例如,在以酶119(下文H2A K119ub)上单体化H2A是一种关键的转化后修饰,涉及转录抑制和DNA修复18、19、20 21,22.H2A K119ub 由 Polycomb 抑制复合体 1 (PRC1) 催化,在维护表观遗传信息方面发挥着关键作用,并且高度保存从果蝇到人类。规范PRC1是由RING1B和BMI1组成,它们是负责上述泛化事件22、23的核心E3泛基体。在果蝇中,H2A单体素(H2A K118ub,对应于哺乳动物中的H2A K119ub)由DUB Calypso逆转,它与附加性梳子(ASX)相互作用,形成聚氨酯抑制DUB(PR-DUB)复合体24。calypso的哺乳动物矫形原,BAP1,是一种肿瘤抑制器,在各种人类恶性肿瘤中被删除或灭活,25,26,27,28, 29,30,31,32,33. BAP1调节细胞核中的DNA依赖过程和内质性细胞凋亡33、34、35、3637,38,39,40,41,42. BAP1组装了多亚单位蛋白复合物,其中含有转录调节剂,特别是ASXL1、ASXL2和ASXL3(ASXLs),ASX38,43的三个正交。ASXL 使用 DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) 域(也称为 ASXM 域)来刺激 BAP1DUB 活动 35、36、44 。因此,ASXL在协调染色质的BAP1 DUB活性和更广泛的肿瘤抑制功能方面发挥着重要作用。
存在几种研究泛化和二分化过程的方法。值得注意的是,使用从细菌中纯化的蛋白质进行生物化学检测在证明特定基质直接普及或去除泛化物方面仍然非常强大。这些实验可以进行,以调查一系列参数,如确定最小复合物的要求,确定反应动力学,定义结构/功能关系,以及了解病理的影响基因突变。在这里,我们提供协议,在染色质基质基材上进行泛化和二甲化反应,具有纯化成分。作为一种模型系统,提出了核糖体H2A蛋白的体外泛化和二次体化。以RING1B/BMI1和BAP1/DEUBAD的最小复合物组装的细菌纯化蛋白分别用于核细胞H2A的泛化或二聚位化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. GSH-agarose 亲和力纯化 GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 泛基丁利加酶复合物
- 使用 pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1-109aa) 细菌表达结构来转化 BL21 (DE3) 细菌 (参见材料表)23。此构造允许将鼠圈 1B 域 1-159 融合到 BMI1 域 1-109,并在 pGEX-6P-2 主干中带有 GST 标记。
- 通过在存在 100 μg/mL 阿霉素和 50 μg/mL 氯霉素的情况下,在 20 mL 的 LB 溴介质中接种表达 GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109 aa) 的 RIL 细菌,执行隔夜启动培养。在37°C过夜时通过摇动孵育。第二天,将起动机培养剂加入含有500 mL新鲜LB肉汤介质(1/26稀释)的1L烧瓶中,并在37°C下在摇床中孵育培养2至4小时。
-
在孵育期间,使用分光光度计测量 600 nm 的 OD。当细菌培养在 600 nm 时达到 0.6 OD 单位时,以 1.5 mL 管中的 1 mL 等分作为非诱导样品。在1L培养物中加入400μM的约丙基β-D-1-硫丙酮(IPTG),以诱导蛋白质表达。在25°C孵育细菌6小时至过夜。
- 在 14,000 x g 下将 1 mL 等分分在 14,000 x g下离心 30 s,丢弃上清液,在 200 μL 的 Laemmli 样品缓冲液中重新悬浮颗粒,并保留用于 SDS-PAGE 和 Coomassie 蛋白诱导的蓝色分析。
- 将诱导细菌培养从烧瓶转移到干净的离心瓶中,在 3,500 x g下旋转 15 分钟,在 4°C 下。丢弃上清液,用40 mL的冷PBS重新悬浮颗粒,在3,500 x g下旋转15分钟,在4°C下。
- 丢弃上清液,将颗粒冻结在-80°C或继续下一步。如果蛋白质在预期的分子量下诱导,则继续下一步。
- 在25 mL的冷赖液缓冲液A(50 mM Tris-HCl pH 7.5) 中重新悬浮细菌颗粒, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 和 1/100 抗蛋白酶鸡尾酒,含有 AEBSF、 阿丙汀、 Bestatin、 E-64、Leupeptin 和 Pepstatin A)。确保所有细菌颗粒已重新悬浮。PMSF 和抗蛋白酶鸡尾酒必须新鲜添加到裂解缓冲液中,仅在细菌裂解时。
警告:始终将样品保存在冰上。
注:可添加100μg/mL的酶酶,以增强细菌分光。 - 在冰上孵育细菌解毒15分钟。使用探针声波器,以70%的输出振幅为30s(4-5x),然后在21,000 x g下在4°C下离心20分钟。
警告:在声波过程中,将样品始终保持在冰上。 - 在离心期间,在15 mL管中加入500μL包装的GSH-agarose珠子(50%泥浆),并在无PMSF和抗蛋白酶的情况下加入10 mL的缓冲A。在 4°C 下短暂混合,在 2,500 g 下旋转 3 分钟,重复此洗涤步骤两次,并将珠子保持在冰上。
- 细菌落水离心后,收集上清液并将其转移到50 mL锥形管中。以100μL的等分作为总液沙,并添加100μL的2x莱姆利样品缓冲液,用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析。
- 通过 0.45 μm 孔注射器过滤器过滤掉的赖沙溶液,并将其与 GSH 珠子混合。在4°C下孵育,摇动5小时。在2,500 x g下旋转珠子3分钟,取出并保存上清液。用含有抗蛋白酶鸡尾酒和PMSF的缓冲剂A洗洗6次蛋白-GSH结合珠(每个5 mL)。
- 上次洗涤后,将珠子连同10 mL的缓冲液转移到空色谱柱中,加入含有25 mM谷胱甘肽的1.5 mL缓冲液A,并通过重力收集洗脱到1.5 mL微管中。重复洗脱过程 4 次。
注:谷胱甘肽库存溶液在50 mM Tris-HCl,pH 7.5中以200mM浓度制备 - 从4个洗液中各取10μL的等分,并加入10μL的2x莱姆利样品缓冲液。这些样品将用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析,以确定纯化蛋白质的存在和纯度。
注:在最后一次洗脱后,将缓冲液中的珠子保持在4°C,以便回收和将来使用。 - 选择显示合理量纯化蛋白质的洗脱分数,以便进一步分析。做一些小的等分的准备。将纯化蛋白质储存在-80°C中。通常,蛋白质浓度为每μL0.5μg至2μg,样品可储存在这种状态下。
- 可选:使用 10K 离心滤波器单元浓缩样品或更换缓冲液
2. BAP1/DEUBAD (ASXL2) 二苯基苯甲酶复合物的纯化
- 使用 pET30a®-His-BAP138和 pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35细菌表达结构,分别转换 BL21 (DE3) RIL 细菌,用于生产 His-BAP1 和 MBP-DEUBAD。
- 通过孵育 He-BAP1 和 MBP-DEUBAD (ASXL2) 在含有 50 μg/mL 氯霉素的 LB 溴和每种质粒的相应抗生素的 LB 溴中表达细菌,执行两种单独的隔夜启动培养物分别为卡那霉素的mL或100μg/mL的阿霉素。置于 37°C 的摇床上。
- 执行步骤 1.3_1.6。
-
在25 mL的冷裂解缓冲液B(50 mM Tris pH 7.3, 500 mM NaCl, 3m β-Mercaptoto乙醇, 0.2% Triton X-100, 1 mM PMSF 和 1/100 抗蛋白酶鸡尾酒) 中重新悬浮细菌颗粒。将His-BAP1的等量与MBP-DEUBAD解毒混合,在冰上孵育15分钟。 Sonicate,然后按照协议1(步骤9)所示将莱沙发生离心机。
- 在离心过程中,用缓冲B洗涤三次,无需PMSF和抗蛋白酶鸡尾酒,制备500μL包装的Ni-NTA抗糖珠(50%浆料)。
- 细菌落水离心后,收集上清液并将其转移到50 mL锥形管中。以100μL的等分作为总液沙,并添加100μL的2x莱姆利样品缓冲液,用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析。
-
通过 0.45 μm 孔隙注射器过滤器过滤掉的赖沙溶液,并将其与 Ni-NTA 珠子混合。在 4°C 下孵育,摇动 5 小时,在 2,500 x g下旋转珠子 3 分钟,取出并保存上清液。
- 用含有 20 mM 1,3-Diaza-2,4-环丙二苯胺(Imidazole)的缓冲液 B清洗珠子 6 次(每个 5 mL)。
注:在pH 7.3下制作2M imidazole的库存溶液。
- 用含有 20 mM 1,3-Diaza-2,4-环丙二苯胺(Imidazole)的缓冲液 B清洗珠子 6 次(每个 5 mL)。
- 上次洗涤后,将具有 10 mL 缓冲液的珠子转移到空色谱柱中,加入含有 200 mM Imidazole 的 1 mL缓冲液B,并通过重力收集洗脱到包含 10 μL DTT (500 mM) 和 2 μL EDTA (500 mM) 的 1.5 mL 微管中,pH:8).重复洗脱程序4次。取每个洗脱分数的10μL,并添加10μL的2x莱姆利样品缓冲液,用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析。汇集所需的洗脱分数。
注:将珠子保存在4°C的缓冲液中,以便回收和将来使用。 -
在用缓冲液C(50 mM Tris pH 7.3,300 mM NaCl、1% Triton X-100、5 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM PMSF 和 1/100 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)孵育之前,用缓冲液 C(50 mM Tris pH 7.3、300 mM NaCl、1% Triton X-100、5 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM PMSF 和 1/100 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)稀释洗脱复合物。
- 用缓冲液C洗涤2次,无需添加PMSF和抗蛋白酶鸡尾酒,即可制备糖糖糖珠(500μL包装)。将珠子加入稀释的洗脱中,在4°C下孵育过夜。
- 在 2,500 x g下离心 3 分钟,并保持流量。用5 mL的缓冲C(5~6x)清洗蛋白质边界珠子。
- 在缓冲D(50mM HEPES pH 8.0、50 mM NaCl、10%甘油和1 mM DTT)的糖角糖珠子上保持纯化的He-BAP1/MBP-DEUBAD复合物,并储存在-80°C。 取20μL的珠子分数(50%珠溶液),并添加20μL的2x莱姆利样品缓冲液,用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析。
3. 从HEK293T细胞中纯化核小体
- 培养HEK293T细胞在完整的Dulbeco的改性鹰的培养基(DMEM)补充5%新生小牛血清(NBS),2mM L-谷氨酰胺,和1%青霉素/链霉素。
- 在转染前一天,在每15厘米培养皿中,在20 mL的完整介质中,将12 x 106 HEK293T细胞盘在板(10个菜)。在转染前,将细胞的培养基更改为12 mL的无血清培养基,用63μl的聚乙烯胺(PEI)在1mg/mL36下转染21μg的pCDNA-Flag-H2A细胞。更改为 12 小时后完成中等。
- 转染后三天,用15mL冰冷的PBS(两次)清洗细胞,并用细胞刮刀在3mL的冰冷PBS中收获。在 2,100 x g下在 4°C 下离心 8 分钟。丢弃 PBS 并进入莱沙步骤或将细胞颗粒冻结在 -80°C。
- 将细胞颗粒悬浮在大约10卷缓冲E(50 mM Tris-HCl pH 7.3,420 mM NaCl,1%NP-40,1 mM MgCl2,1mMPMSF,1/100蛋白酶抑制剂鸡尾酒和20 mM N-甲基马列米德(NEM)中,并在冰上孵育20分钟。 N-甲基溴酰胺(NEM)对于抑制与核小体共同纯化的DUB至关重要。
-
在3,000 x g离心5分钟后,丢弃上清液,将染色质颗粒重新悬浮在10卷缓冲液E.通过反转混合,在3,000 x g下离心5分钟。
- 使用缓冲液 E再次重复洗涤步骤,两次使用缓冲液F"MNase 缓冲液"(20 mM Tris-HCl pH 7.5,100 mM KCl,2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.3 M 蔗糖, 0.1% NP-40, 1 mM PMSF 和 1/100 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。
注意:小球在进行处理和离心时会漂浮。
- 使用缓冲液 E再次重复洗涤步骤,两次使用缓冲液F"MNase 缓冲液"(20 mM Tris-HCl pH 7.5,100 mM KCl,2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.3 M 蔗糖, 0.1% NP-40, 1 mM PMSF 和 1/100 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。
- 将染色质重新悬浮在 5 mL缓冲液 F中,用微球菌核酸酶 (MNase) 处理颗粒(3 U/mL,在室温下 10 分钟)。
注:使用大数质器混合可辅助反应。 -
孵育后,服用40μL等分的混合物,用于核体DNA片段的分析。将此等分与 40 μL 的苯酚/氯仿和 20 μL 的 6x DNA 加载缓冲液、涡旋、在 18,000 x g下旋转 2 分钟,并将 DNA 加载到 2% 的 agarose 凝胶上。
- 当DNA主要是一个147bp片段对应于单核糖体,停止反应,在最终浓度时加入5mM EDTA。
- 在21,000 x g下离心20分钟后,在4°C下,用抗旗树脂孵育可溶性染色质部分,在4°C下孵育。用 6x缓冲液G(50 mM Tris-HCl、pH 7.3、5 mM EDTA、150 mM NaCl、1% NP-40、1 mM PMSF、1 mM DTT、1/100蛋白酶抑制剂鸡尾酒)清洗珠子。
- 将带 5 mL缓冲液 G的珠子转移到空色谱柱中。用200μg/mL的旗洗脱肽洗脱珠约束核小体。使用由含有200μg/mL标志洗脱肽(见材料表)和1/5(vol:vol)1 M Tris,pH 8.0的缓冲液组成的洗脱缓冲液。使用 260 μL 标志洗脱缓冲液(每个洗脱 2 小时)将核小体 3 倍洗脱。
- 通过使用等分法提取苯酚氯仿,测试3个洗脱液,并将DNA加载到2%的甘蔗糖凝胶中。取每个洗脱分数的10μL,加入10μL的Laemmli样品缓冲液2x用于SDS-PAGE和Coomassie蓝色分析,并加载每个洗脱物,用于西带化H2A检测。将洗脱储存在-80°C。一般来说,从人体细胞中纯化产生的蛋白质量少于细菌的蛋白质含量,其浓度范围为0.1至0.5微克/μL。
4. 使用BMI1/RING1B E3泛素利加酶复合物进行核糖体泛素测定
- 通过 10K 孔隙 0.5 ml 离心滤波器将核小体离心,将基板从洗脱液液液转移到反应缓冲液H(25 mM Tris,pH 7.5;10 mM MgCl2和 5 mM ATP)。或者,市售的核小体可用于测定。
注:将基板悬浮液更改为反应缓冲液可确保可重复性,并防止旗洗脱混合物中存在的化合物对潜在的E3结合抑制。 - 在40μL的缓冲液H总体积中孵育1μg的核小体。加入 Ub 激活酶 (UBE1) (250 ng)、Ub (50 ng/μL) 和 E2 Ub-结合酶 (672 ng) 和 1 μg BMI1/RING1B E3 泛基辛结合酶复合物。在37°C下孵育反应3小时,偶尔摇动。
注:多个控制可以并行进行,包括省略、E1、E2、E3、ATP 和泛基丁。这确保了泛化反应的特异性。 - 根据标准程序,通过加入40 μL的2xLammli样品缓冲液,通过SDS-PAGE和西印分析组蛋白H2A K119的泛化,从而停止反应。使用抗H2A或抗H2A K119ub抗体(见材料表)。
5. 使用 BAP1/DEUBAD 的体外核体内核体 H2A DUB 测定
- 使用纯化核小体进行体外二核素测定。在 40 μL缓冲液I(50 mM Tris-HCl、pH 7.3、1 mM MgCl 2、50mM NaCl 和 1 mM DTT)中重新悬浮 100-500 ng 的核小体。加入1μg的BAP1细菌纯化His-BAP1和MBP-DEUBAD。在37°C下进行3小时双基反应,偶尔摇动。
- 通过加入40μL的2x莱姆利缓冲液,停止体外反应,并通过免疫凝固进行分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GST-BMI1和RING1B蛋白在细菌中生产良好,可轻易提取为可溶性成分。图 1A显示了用于典型纯化 GST-BMI1-RING1B 复合物的 Coomassie 蓝色染色。GST-BMI1 和 RING1B 波段以预期的分子量迁移,分别为 ±45 kDa 和 +13 kDa。值得注意的是,E3连带复合物高度均匀,细菌蛋白污染物和/或降解产物水平极低。此外,纯化复合物的化学测量是最佳的,因为当摩尔比为1:1时,GST-RING1B蛋白的带强度预计将比BMI1强2到3倍。同样,His-BAP1/MBP-DEUBAD 复合物的纯化也导致带子的相对高度均匀的制剂,其频段分别为 +90 kDa 和 +55 kDa(图 1B)。通过镍-琼糖和杏仁糖分别对BAP1和DEUBAD的串联亲亲化纯化,分别确保和充分进行化学测量,并从纯化复合物中去除游离的BAP1。另一方面,纯化的核体分数基本上由147bp带组成,指示存在高富倍量单核糖体分数(图1C)。这些纯化核小体的蓝色染色显示了四个组蛋白亚单位的典型带状模式,具有化学计量量(图1D)。当分别迁移到SDS-PAGE和Agarose凝胶上时,市售的重组单核糖体也显示类似的蛋白质和DNA模式。值得注意的是,在HEK293T纯化核小体上,H2A和Flag-H2A的单二基化形式很容易区分。我们使用重组核小体与E1/E2/泛素/ATP一起使用,并观察到组蛋白H2A与BMI1-RING1B复合物的泛化表明蛋白质的泛化形式随时间相关增加,而未修饰形式的水平是同时减少。泛化反应是总的,因为几乎所有的H2A蛋白都转化为H2A K119ub(图1E)。另一方面,对原生核小体进行二次核素测定。在用BAP1/DEUBAD孵育这些核小体后,我们观察到H2A K119ub信号的依赖于时间的减少(图1F)。请注意,使用抗 H2A K119ub 观察到的两个泛化 H2A 波段对应于转染的 Flag-H2A 和内源性 H2A 迁移,分别以 ±30 kDa 和 +25 kDa 波段迁移。
图1:纯化、泛化和二次白化。(A) 纯化GST-RING1B-BMI1蛋白质,并使用库马西蓝色染色进行分析。GST-RING1B-BMI1在细菌中产生,并使用GST亲和珠进行纯化。为了确认纯化纯度和蛋白质大小,在15%的SDS-PAGE凝胶上装上洗脱液,并沾染了库马西蓝。不同数量的BSA用于确定蛋白质数量。对染色凝胶进行扫描以生成图形。(B) MBP-DEUBAD/His-BAP1复合物的净化.MBP-DEUBAD和HIS-BAP1在细菌中单独生产。变乳后,用镍和麦芽糖珠混合和纯化了MBP-DEUBAD和HIS-BAP1。纯化复合物被装在8%的SDS-PAGE凝胶上,并沾染了库马西蓝。(C) 在MNase治疗后对单核糖体进行纯化。从HEK293T表达pcDNA.3 Flag-H2A的色母被提取和处理与MNase产生和纯化单核糖体。为了确认单核糖体的产生,在紫外线下提取和检测苯氯仿时,取了一小部分染色质。加载在2%的甘蔗凝胶揭示了典型的147基对DNA片段,指示单核糖体。(D) 纯化单核糖体用于库马西蓝色染色.(E) 核小体体体外通联.重组核小体在37°C下用细菌纯化的E3泛素利带二聚体、GST-RING1B/BMI1和E1/E2/ATP/Ubiquitin孵育,在规定的时间。H2A单体化(H2A K119ub)由西方印迹分析。(F) 使用 BAP1/DEUBAD 二苯基辛酶复合物对 H2A K119ub 进行二次二甲基测定。使用细菌纯化的His-BAP1/MBP-DEUBAD和哺乳动物纯化核小体进行体外二核化测定。反应是做起诉的时间,并分析由西方印迹。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:协议的控制和概述。(A) 纯化哺乳动物BAP1或其催化死突变体(C91S)以及细菌纯化重组剂BAP1用于核小体H2A二氧化基化。单独用缓冲液孵育或从模拟纯化中获得的洗脱液的核弹组也作为对照包括在内。(B) BAP1不二甲基化H2A K13/K15,其泛化由RNF168 E3连体介导。HEK293T 细胞与 H2A K13R/K15R 或 H2A K118R/K119R 以及 RNF168 一起共同转染,以确保 K13/K15 残留物的泛化。纯化的核小体用于BAP1复合物的二次脱脂。反应在不同的时间点停止,并受到免疫凝固。(C) 从哺乳动物细胞中与BAP1复合物中非泛化和单一基化DEUBAD进行纯化。纯化复合物用于核糖体H2A K119ub的二恶一发测定。对指示的时间点进行了反应,并通过西方印迹进行分析。(D) BAP1 二苯基丁物 H2A K119ub 在体内。HEK293T细胞与H2A或H2A突变体(H2A K118R、K119R、K118R/K119R或K13R/K15R)以及BAP1和ASXL2结构共同转染。转染后两天,使用所述抗体采集细胞进行免疫印迹。(E) 实验工作流程的原理表。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
建立健壮的体外泛化和二次成体测定对感兴趣的蛋白质有几个优点。这些测定可用于:(i) 建立最佳条件并定义这些反应的最低要求,(ii) 确定酶动力学和生化常数,(iii) 定义可能影响这些反应的辅助因子或抑制剂的作用,(iv)识别相互作用界面,(v) 测试人工或疾病相关突变的影响,(vi) 建立可进一步用于开发高通量化学筛选检测的测定条件。在这里,我们通过描述我们如何在核体基板上执行BMI1/RING1B介导的H2A通位和BAP1/ASXL介导的H2A二苯基体化来说明这些测定。
组蛋白H2A的泛化可以用最少的成分在体外重述,因为使用BMI1-RING1B复合物几乎可以完全普及H2A。值得注意的是,这种反应是在重组核小体上进行的。这些的优点是,在哺乳动物细胞中,没有其他组织蛋白的翻译后修饰。尽管如此,在原生核小体上也可以有效地进行泛化反应。如果泛化反应弱,酶与基质的比例可以增加,以观察最佳泛化结扎。值得注意的是,如果在基板普及后进行二次基化反应或相互作用测定,则可直接在珠结合基板上进行泛化。泛化基板可以通过下拉回收,可丢弃含有泛化反应成分的上清液。然而,当酶特性要建立时,酶需要洗脱,并且通过大小排除色谱法评估成分的化学计量。
比比基反应需要的成分比泛化反应少。然而,仅对DEUBAD进行纯化通常会导致蛋白质沉淀。重要的是,当DEUBAD用BAP1进行纯化时,这大大增加了它的溶解度。值得注意的是,我们建议对各种量的基质和酶复合物进行二次测定。染色质过量可以抑制二甲基化反应,这可能通过增加与核小体相关的抑制剂浓度来解释。我们还观察到过量的游维化BAP1。因此,必须包括几个控制,例如单独用BAP1孵育核小体(图2A)。还必须注意,一些DUB可能与染色质共同净化,即使我们用NEM治疗染色质,DUB在添加DTT后可能会部分重新激活,从而减少催化半胱氨酸。此外,金属蛋白酶DUBs也可能存在,这些酶对NEM不敏感,因此不被抑制。因此,应包括额外的控制,只包括核小体,而不添加酶和DUB催化死突变体(图2A)。值得注意的是,BAP1 DUB活性对H2A K119ub的特异性有据可查,并在我们的测定条件下得到了验证。我们从HEK293T细胞核小体中纯化,表达H2A K118/K119R或H2A K13/K15R。RNF168的表达导致K13/K15上重要的泛化。BAP1 DUB活性仅在含有H2A K13/K15R的核小体上观察到,对应于H2A K119ub(图2B)。另一个考虑因素是,对酶活性至关重要的翻译后修饰很可能不存在于细菌蛋白中。因此,使用从哺乳动物细胞中纯化的成分进行体外反应也可以被认为是35。例如,在较高的真核生物中观察到的DEUBAD的单倍化,极大地促进了BAP135的二核基辛酶活性(图2C)。因此,也可以考虑从哺乳动物细胞中纯化成分。除了体外反应外,在转染后可以直接监测细胞中的BAP1 DUB活性。例如,具有H2A结构的HEK293T细胞转染,由于其在细胞中的丰度,可以发出H2A K119ub的明确信号。在这些条件下,大多数的泛化发生在K118/K119残留物上,因为这些位点对精氨酸的突变导致H2A全泛化完全不存在(图2D)。共同表达BAP1和ASXL2以及H2A可以结束细胞中的BAP1DUB活性。但是,需要考虑几点,因为过度表达可能会导致错误的结果。因此,这些实验需要优化和良好控制。
总之,此处描述的协议(图 2E中概述)非常简单,不需要专门的基础结构或实验设置,并且可以放大以产生大量经过修饰的核小体体,用于多个下游应用,包括酶测定、质谱和蛋白质-蛋白质相互作用测定。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢戴安娜·阿贾乌德的技术援助。这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究理事会(2015-2020年)、魁北克基因组(2016-2019年)和加拿大基因组(2016-2019年)的资助,获得E.B.A.E.B.A.的资助,是魁北克圣地基金会(FRQ-S)的高级学者。L.M.和N.S.K.拥有FRQ-S的博士学位奖学金。H.B拥有来自高等教育部和突尼斯科学研究部和科尔基金会的博士学位奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
References
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
- Ciechanover, A.
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
- Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
- Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
- Yau, R., Rape, M.
- Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
- Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
- Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B.
- Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
- Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
- Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
- Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
- Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
- Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
- Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
- Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
- Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
- Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
- Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
- Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
- Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
- Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
- Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
- Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
- Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
- Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
- Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
- Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
- Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
- Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
- Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
- Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
- Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
- Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
- Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).
