Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales
Summary
La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en los procesos celulares y está estrechamente coordinada por la desubiquitinación. Los defectos en ambas reacciones subyacen a patologías humanas. Proporcionamos protocolos para la realización de la ubiquitinación y la reacción de desubiquitinación in vitro utilizando componentes purificados.
Abstract
La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en varias vías de señalización y participa notablemente en la coordinación de la función de la cromatina y los procesos asociados al ADN. Esta modificación implica una acción secuencial de varias enzimas, incluyendo E1 ubiquitina activa, E2 ubiquitina-conjugating y E3 ubiquitina-ligasa y es revertida por deubiquitinasas (DUBs). La ubiquitinación induce la degradación de las proteínas o la alteración de la función proteica incluyendo la modulación de la actividad enzimática, la interacción proteína-proteína y la localización subcelular. Un paso crítico para demostrar la ubiquitinación o desubiquitinación de proteínas es realizar reacciones in vitro con componentes purificados. Las reacciones efectivas de ubiquitinación y desubiquitinación podrían verse muy afectadas por los diferentes componentes utilizados, los cofactores enzimáticos, las condiciones de amortiguación y la naturaleza del sustrato. Aquí, proporcionamos protocolos paso a paso para llevar a cabo reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación. Ilustramos estas reacciones utilizando componentes mínimos del ratón Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1 y RING1B, una ligasa de ubiquitina E3 que monoubiquitina histone H2A en lisina 119. La desubiquitinación de H2A nucleosomal se realiza utilizando un complejo mínimo de desubiquitinación represiva de policomb (PR-DUB) formado por la deubiquitinasa humana BAP1 y el dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) de su cofactor ASXL2. Estos ensayos de ubiquitinación/desubiquitinación se pueden llevar a cabo en el contexto de nucleosomas recombinantes reconstituidos con proteínas purificadas por bacterias o nucleosomas nativos purificados a partir de células de mamíferos. Destacamos las complejidades que pueden tener un impacto significativo en estas reacciones y proponemos que los principios generales de estos protocolos puedan adaptarse rápidamente a otras ligasas y deubiquitinasas de la ubiquitina E3.
Introduction
La ubiquitinación es una de las modificaciones post-traduccionales más conservadas y es crítica para una amplia variedad de organismos, incluyendo levaduras, plantas y vertebrados. La ubiquitinación consiste en la unión covalente de ubiquitina, un polipéptido de 76 aminoácidos altamente conservado, a proteínas diana y se produce en tres pasos secuenciales que implican tres enzimas, es decir, E1-activación, E2-conjugating y E3 ligeas1, 2,3. Esta modificación post-traduccional desempeña un papel central en un amplio espectro de procesos biológicos. De hecho, las ligasas E3, que proporcionan la especificidad de la reacción, constituyen una gran superfamilia de enzimas y son las enzimas más abundantes del sistema de ubiquitina4,5,6. Los efectos aguas abajo de la ubiquitinación de proteínas dependen de la naturaleza de la modificación: monoubiquitinación, multimonoterminización, y poliubiquitinación lineal o ramificada. La monoubiquitinación rara vez se asocia con la degradación proteasomal, pero en su lugar esta modificación está implicada en la mediación de varios eventos de señalización. La poliubiquitinación implica el N-terminal o los residuos de lisina en la propia molécula de ubiquitina, y el destino de una proteína poliubiquitinizada depende de qué residuo está involucrado en la extensión de la cadena de ubiquitina. Durante mucho tiempo se ha sabido que la poliubiquitinación mediada por la lisina 48 de ubiquitina induce degradación proteasomal. Por el contrario, poliubiquitinación a través de lisina 63 de ubiquitina se asocia a menudo con la activación de proteínas7,8,9. Al igual que otras modificaciones importantes post-traduccionales, la ubiquitinación es reversible y la eliminación de ubiquitina de proteínas está garantizada por proteasas específicas las que se denominan deubiquitinasas (DUB), que han surgido como reguladores importantes de los procesos celulares 2 , 10. Es importante destacar que muchos DUB son altamente especializados, y regulan, a través de la desubiquitinación, sustratos específicos, lo que indica que un equilibrio fino entre ubiquitinación y desubiquitinación es crítico para la función proteica. Los E3 y los DUB, junto con la maquinaria de degradación del proteosoma y los factores accesorios, forman el Sistema de Proteasoma de Ubiquitina (UPS, con >1200 genes) que regula las principales vías de señalización, varias de las cuales están asociadas con el crecimiento y la proliferación celular, determinación del destino celular, diferenciación, migración celular y muerte celular. Es importante destacar que la desregulación de varias cascadas de señalización que implican ubiquitinación promueve enfermedades de tumorigénesis y neurodegeneración5,11,12,13, 14.
La ubiquitinación desempeña un papel generalizado en la biología de la cromatina y en los procesos dependientes del ADN15,16,17. Por ejemplo, la monoubiquitinación de histona H2A en lisina 119 (en adelante H2A K119ub) es una modificación crítica post-traduccional implicada en la represión transcripcional y la reparación del ADN18,19,20, 21,22. H2A K119ub es catalizado por el Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), que desempeña un papel clave en el mantenimiento de la información epigenética y está altamente conservado de Drosophila a humano. La PRC1 canónica está constituida en particular por el RING1B y el BMI1, que son el complejo de ligasa de ubiquitina E3 responsable del evento de ubiquitinación22,23. En Drosophila, la monoubiquitinación H2A (H2A K118ub que corresponde a H2A K119ub en mamíferos) es revertida por el DUB Calypso, que interactúa con el Peine Sexual Adicional (ASX) formando el complejo DE Podo-REpressivo DUB (PR-DUB)24. El ortología de mamíferos de calipso, BAP1,es un supresor tumoral suprimido o inactivado en diversas neoplasias malignas humanas25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 regula los procesos dependientes del ADN en el núcleo y la apoptosis mediada por la señalización de calcio en el retículo endoplasmático33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 ensambla complejos proteicos multisubunidadques reguladores de transcripción, en particular ASXL1, ASXL2 y ASXL3 (ASXL), tres ortologos de ASX38,43. Los ASXL utilizan el dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), también llamado dominio ASXM, para estimular la actividad BAP1 DUB35,36,44. Por lo tanto, los ASXL desempeñan un papel importante en la coordinación de la actividad DE BAP1 DUB en la cromatina y, más ampliamente, en su función supresora de tumores.
Existen varios métodos para estudiar los procesos de ubiquitinación y desubiquitinación. En particular, los ensayos bioquímicos que utilizan proteínas purificadas a partir de bacterias siguen siendo muy potentes para demostrar la ubiquitinación directa de sustratos específicos o la eliminación de ubiquitina de ellos. Estos experimentos se pueden llevar a cabo para investigar una serie de parámetros tales como determinar el requisito de complejos mínimos, determinar la cinética de reacciones, definir relaciones estructura/función y comprender el impacto de la patológica mutaciones genéticas. Aquí, proporcionamos protocolos para llevar a cabo reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación en sustratos de cromatina con componentes purificados. Como sistema modelo, se presenta la ubiquitinación in vitro y la desubiquitinación de la proteína nucleosomal H2A. Las proteínas purificadas por bacterias ensambladas en complejos mínimos de RING1B/BMI1 y BAP1/DEUBAD se utilizan para la ubiquitinación o desubiquitinación de H2A nucleosomal, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varias ventajas de establecer ensayos robustos de ubiquitinación in vitro y desubiquitinación para proteínas de interés. Estos ensayos se pueden utilizar para: (i) establecer condiciones óptimas y definir requisitos mínimos para estas reacciones, (ii) determinar constantes cinéticas y bioquímicas enzimáticas, (iii) definir las funciones de los cofactores o inhibidores que pueden afectar a estas reacciones, (iv) identificar interfaces de interacción, (v) probar el impacto de mutaciones artificiales o asociad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Diana Adjaoud por la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) y Genome Canada (2016-2019) a E.B.A. E.B.A. es un estudiante senior de los Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L.M y N.S.K. tienen una beca de doctorado del FRQ-S. H.B tenía una beca de doctorado del Ministerio de Educación Superior y de Investigación Científica de Túnez y la Fundación Cole.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
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