Summary

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Published: July 25, 2019
doi:

Summary

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Abstract

Ubiquitination çeşitli sinyalizasyon yolları önemli roller oynar ve özellikle kromatin fonksiyon ve DNA ilişkili süreçlerin koordinasyonunda yer alan bir post-translational modifikasyonudur. Bu modifikasyon E1 Ubiquitin-aktive, E2 Ubiquitin-konjugating ve E3 Ubiquitin-ligaz dahil olmak üzere çeşitli enzimlerin sıralı bir eylem içerir ve deubiquitinases (DUBs) tarafından tersine çevrilir. Ubiquitination proteinlerin bozulması veya enzimatik aktivite, protein-protein etkileşimi ve hücre altı lokalizasyonu modülasyonu dahil protein işlevinin değiştirilmesi indükler. Protein mayası veya deubiquitination gösteren kritik bir adım, arıtılmış bileşenlerle in vitro reaksiyonlar gerçekleştirmek için. Etkili mayası ve deubiquitination reaksiyonlar büyük ölçüde kullanılan farklı bileşenler tarafından etkilenebilir, enzim Co-faktörleri, tampon koşulları, ve substrat doğası.  Burada, biz mayası ve deubiquitination reaksiyonlar yürütmek için adım adım protokoller sağlar. Biz fare polycomb baskıcı kompleksi 1 (PRC1), BMI1 ve RING1B, lizin 119 üzerinde histon H2A monoubiquitinates bir E3 Ubiquitin ligaz en az bileşenleri kullanarak bu reaksiyonlar göstermektedir. Nükliosomal H2A deubiquitination, insan deubiquitinase BAP1 ve DEUBiquitinase adaptörü (DEUBAD) tarafından oluşturulan minimal Polycomb baskıcı Deubiquitinase (PR-DUB) kompleksi kullanılarak gerçekleştirilir, onun co-Factor ASXL2 alan. Bu ubiquitination/deubiquitination kuralları bakteriler-arıtılmış proteinler veya memeliler hücrelerinden arındırılmış yerli nükreosomlar ile yeniden rekombinant nüklisomes bağlamında yapılabilir. Bu reaksiyonlar üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilecek inceliklerini vurgulıyoruz ve bu protokollerin genel prensiplerinin diğer E3 Ubiquitin ligazları ve deubiquitinases ‘e hızlı bir şekilde uyarlanabilir olduğunu öneriyoruz.

Introduction

Ubiquitination en çok kayıtlı post-translational değişikliklerden biridir ve Maya, bitkiler ve omurgalı gibi organizmaların geniş bir yelpazede için önemlidir. Ubiquitination Ubiquitin kovalent eki oluşur, bir son derece koruma 76 amino asit polipeptide, proteinleri hedef ve üç sıralı adımda 3 enzim içeren oluşur, yani, E1-aktive, E2-konjugating ve E3 ligaz1, 2,3. Bu post-translational modifikasyon biyolojik süreçlerin geniş bir spektrumunda merkezi roller oynar. Gerçekten de, reaksiyon özgüllüğü sağlayan E3 Ligas, enzimlerin büyük bir süper ailesi oluşturur ve Ubiquitin sisteminin en bol enzimleri vardır4,5,6. Protein mayası aşağı akım etkileri modifikasyon doğası bağlıdır: monoubiquitination, Multi-monoubiquitination, ve doğrusal veya dallanmış polyubiquitination. Monoubiquitination nadiren proteasomal bozulması ile ilişkilidir, ancak bunun yerine bu değişiklik çeşitli sinyalizasyon olaylarını aracılık yer almaktadır. Polyubiquitination, N-terminali veya Ubiquitin molekülü içinde lizin kalıntıları içerir ve polyubiquitinated protein kaderi hangi kalıntı Ubiquitin zincir uzatma dahil bağlıdır. Uzun süre, Ubiquitin lizin 48 tarafından aracılı polyubiquitination proteasomal bozulması indükler bilinmektedir. Aksine, Ubiquitin lizin 63 ile polyubiquitination genellikle protein aktivasyonu ile ilişkilidir7,8,9. Diğer önemli post-translational değişikliklere benzer şekilde, mayası geri dönüşümlü ve proteinlerden Ubiquitin kaldırılması, hücresel süreçlerin önemli regülatörleri olarak ortaya çıkan deubiquitinases (Dubs) olarak adlandırılan spesifik proteinler tarafından sağlanır 2 , 10. önemlisi, birçok Dubs son derece uzmanlaşmıştır ve düzenleyen, deubiquitination yoluyla, belirli substratlar, mayası ve deubiquitination arasında ince bir denge protein fonksiyonu için kritik olduğunu gösteren. E3s ve Dubs, proteasom bozulma makine ve aksesuar faktörleri ile birlikte, birçok hücre büyümesi ve proliferasyon ile ilişkili olan büyük sinyal yolları düzenleyen Ubiquitin proteozom sistemi (UPS, > 1200 genler ile) formu, hücre kaderi belirlenmesi, farklılaşma, hücre göçü ve hücre ölümü. Önemlisi, mayası içeren çeşitli sinyalizasyon Cascades deregülasyon tümörijenezde ve Nörodejenerasyon hastalıkları teşvik5,11,12,13, 14oldu.

Ubiquitination kromatin biyoloji ve DNA bağımlı süreçlerde yaygın roller oynar15,16,17. Örneğin, lizin 119 (bundan sonra H2A K119ub) histon H2A monoubiquitination transkripsiyon baskı ve DNA onarım dahil kritik bir post-translasyonel modifikasyonudur18,19,20, 21,22. H2A K119ub, epigenetik bilgilerinin bakımını önemli bir rol oynayan ve Drosophila ‘dan insana son derece muhafaza edilen Polycomb baskıcı kompleksi 1 (PRC1) tarafından katalizlenir. Canonical PRC1 özellikle RING1B ve BMI1, yukarıda belirtilen mayası olay22,23sorumlu çekirdek E3 Ubiquitin ligaz kompleksi tarafından oluşturulur. Drosophila, H2A monoubiquitination (H2A K119ub mammalians KARŞıLıK gelen H2A K118UB) Dub Calypso tarafından tersine, hangi ek seks tarak ile etkileşim (ASX) polycomb-BASKıCı Dub (PR-Dub) kompleksi oluşturan24. Calypso, BAP1, memeli ortoloğundan bir tümör bastırıcı silinmiş veya çeşitli insan malignite içinde inaktive olduğunu25,26,27,28, 29 , 30 ‘ dan fazla , 31 , 32 , 33. BAP1, endoplazmik retikulum33,34,35,36, çekirdek ve kalsiyum sinyalizasyon-aracılı apoptoz DNA bağımlı süreçleri düzenler 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1, özellikle ASXL1, ASXL2 ve ASXL3 (asxls), asx38,43üç ortolog transkripsiyon regülatörleri içeren Multi-subunit protein kompleksler birleştirir. Asxls deubiquitinase adaptörü (Deubad) etki alanı, ayrıca asxm etki alanı, BAP1 Dub aktivite35,36,44uyarmak için kullanın. Bu nedenle, asxls kromatin ve daha geniş tümör bastırıcı fonksiyonu BAP1 Dub aktivite koordine önemli roller oynar.

Çeşitli yöntemler, her yerde ve deubiquitination süreçleri incelemek için mevcut. Özellikle, bakterilerden arındırılmış proteinlerin kullanıldığı biyokimyasal maddeler, belirli substratlar ile doğrudan Ubiquitin veya çıkarılması ile ilgili olarak çok güçlü kalır. Bu deneyler, minimal kompleksleri ihtiyacını belirleme, reaksiyonlar kinetiği belirleme, yapı/fonksiyon ilişkilerini tanımlama ve patolojik etkisinin anlaşılması gibi bir dizi parametreyi araştırmak için yapılabilir. gen mutasyonları. Burada, saflaştırılmış bileşenlerle kromatin substratlar üzerinde her yerde ve deubiquitination reaksiyonları yapmak için protokoller sağlıyoruz. Bir model sistemi olarak, In vitro mayası ve nükliosomal H2A protein deubiquitination sunulmaktadır. RING1B/BMI1 ve BAP1/Deubad minimal kompleksleri içinde toplanan bakteriler-saflaştırılmış proteinler sırasıyla nükmonozomal H2A mayası veya deubiquitination için kullanılır.

Protocol

1. GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin ligaz kompleksi GSH-agarose yakınlık arıtma PGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) bakteri ifadesi oluşturmak BL21 (DE3) bakterileri (bkz. malzeme tablosu)23dönüştürmek için kullanın. Bu yapı, pgex-6p-2 omurgasında GST etiketiyle BMI1 etki alanı 1-109 için erimiş RING1B etki alanı 1-159 murine ifadesi sağlar. 100 μg/ml ampisilin ve 50 μg/ml chloramphenicol varlığı içinde 20 ml lb su…

Representative Results

GST-BMI1 ve RING1B proteinleri iyi bakterilerde üretilmektedir ve çözünür fraksiyonda kolayca ayıklanabilir. Şekil 1a GST-BMI1-RING1B kompleksi tipik bir arıtma Için bir Coomassie mavi boyama gösterir. GST-BMI1 ve RING1B bantları beklenen moleküler ağırlıkta, ~ 45 kDa ve ~ 13 kDa sırasıyla göç. Özellikle E3 ligaz kompleksi çok düşük düzeyde bakteri proteinlerinin kontaminantları ve/veya bozulma ürünleri ile son derece homojen. Daha…

Discussion

İlgi proteinleri için sağlam In vitro mayası ve deubiquitination asder kurulmasının çeşitli avantajları vardır. Bu göstericiler için kullanılabilir: (i) optimum koşullar kurmak ve bu reaksiyonlar için minimal gereksinimi tanımlamak, (ii) enzimatik kinetik ve biyokimyasal sabitler belirlemek, (iii) bu reaksiyonları etkileyebilir Kofaktörler veya inhibitörlerin rollerini tanımlamak, (iv) etkileşim arayüzlerini tanımlayın, (v) yapay veya hastalıkla ilişkili mutasyonların etkisini test edin ve (vi)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Teknik yardım için Diana Adjaoud ‘a teşekkür ederiz. Bu çalışma Doğal Bilimler ve Kanada Mühendislik Araştırma Konseyi (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) ve Genome Kanada (2016-2019) E.B.A. E.B.A. için hibe tarafından destekleniyordu Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S) üst düzey bir bilim adamı. L. M ve N.S.K., FRQ-S ‘ d e k i Doktora Bursu. H. B Yüksek Eğitim Bakanlığı ve Tunus bilimsel araştırmalar ve Cole Vakfı ‘ndan Doktora Bursu aldı.

Materials

Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

References

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation – the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).

Play Video

Cite This Article
Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O., Sen Nkwe, N., Barbour, H., Iannantuono, N. V., Boubekeur, A., Daou, S., Affar, E. B. In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones. J. Vis. Exp. (149), e59385, doi:10.3791/59385 (2019).

View Video