ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ
Summary
ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。
Abstract
ユビキチン化は、様々なシグナル伝達経路において重要な役割を果たし、クロマチン機能とDNA関連プロセスの調整に特に関与する翻訳後修飾である。この修飾は、E1ユビキチン活性化、E2ユビキチン結合およびE3ユビキチン-リガゼを含むいくつかの酵素の逐次作用を伴い、デュビキチナーゼ(DUB)によって逆転される。ユビキチン化は、酵素活性の変調、タンパク質とタンパク質の相互作用および細胞下局在化を含むタンパク質機能の分解またはタンパク質機能の変化を誘発する。タンパク質ユビキチン化またはデュビキチン化を実証する上で重要なステップは、精製された成分を用いてインビトロ反応を行うことです。有効なユビキチン化およびデュビキチン化反応は、使用される異なる成分、酵素共因子、緩衝条件、および基板の性質によって大きく影響を受ける可能性があります。 ここでは、ユビキチン化およびデュビキチン化反応を行うためのステップバイステップのプロトコルを提供する。これらの反応は、マウスポリコム抑圧複合体1(PRC1)、BMI1、およびRING1B、リジン119上のヒストンH2Aを単一ユビキチン化するE3ユビキチンリゲスを用いて示す。ヌクレオソームH2Aのデュビキチン化は、ヒトデュビキチネーゼBAP1およびDEUBiquitinaseeAAptor(DEUBAD)ドメインの共因子ASXL2によって形成された最小限のポリコム抑圧デュビキチネーゼ(PR-DUB)複合体を用いて行われる。これらのユビキチン化/デュビキチン化アッセイは、細菌精製タンパク質または哺乳動物細胞から精製された天然核ソームで再構成された組換えヌクレオソームのいずれかの文脈で行うことができる。我々は、これらの反応に重大な影響を及ぼす可能性のある複雑さを強調し、これらのプロトコルの一般的な原理が他のE3ユビキチンリガスおよびデュビキチナーゼに迅速に適応できることを提案する。
Introduction
ユビキチン化は、翻訳後の最も保存された修飾の1つであり、酵母、植物、脊椎動物を含む多種多様な生物にとって重要です。ユビキチンは、高度に保存された76アミノ酸ポリペプチドであるユビキチンの共生結合から成り、タンパク質を標的とし、3つの酵素、すなわち、E1活性化、E2-共役およびE3リゲス1を含む3つの順次ステップで起こる。 2,3.この翻訳後の改変は、生物学的プロセスの広いスペクトルで中心的な役割を果たしています。実際、反応の特異性を提供するE3リチウムは、酵素の大きなスーパーファミリーを構成し、ユビキチン系4、5、6の最も豊富な酵素である。タンパク質ユビキチン化の下流効果は、単一ユビキチン化、多単一ビキチン化、線形または分岐ポリユビキチン化の性質に依存する。モノウビキチン化はプロテアソーム分解と関連することはほとんどないが、代わりにこの修飾は様々なシグナルイベントの媒次に関与する。ポリウビキチン化は、ユビキチン分子自体のN末端またはリジン残基を含み、ポリユビキチン化タンパク質の運命は、ユビキチン鎖拡張に関与する残基に依存する。ユビキチンのリジン48によって媒介されるポリウビキチン化がプロテアソーム分解を誘導することを長い間知られている。反対に、ユビキチンのリジン63を介したポリウビキチン化は、しばしばタンパク質活性化7、8、9と関連している。他の重要な翻訳後修飾と同様に、ユビキチンは可逆的であり、タンパク質からのユビキチン除去は、細胞プロセスの重要な調節剤として出現したドゥビキチナーゼ(DUB)と呼ばれる特定のプロテアーゼによって保証される。2,10.重要なことに、多くのDUBは高度に専門化されており、また、デュビキチン化を通じて、特定の基質を調節し、タンパク質機能に対するユビキチン化とデュビキチン化の微妙なバランスが重要であることを示す。E3とDUBは、プロテアソーム分解機構およびアクセサリ因子と共に、主要なシグナル伝達経路を調節するユビキチンプロテアソームシステム(UPS、>1200遺伝子)を形成し、そのうちのいくつかは細胞増殖および増殖に関連する。細胞の運命の決定、分化、細胞移動、および細胞死。重要なことに、ユビキチン化を伴ういくつかのシグナル伝達カスケードの規制緩和は、腫瘍形成および神経変性疾患5、11、12、13を促進する。14.
ユビキチン化は、クロマチン生物学およびDNA依存プロセス15、16、17において広範な役割を果たす。例えば、リジン119上のヒストンH2Aの単一化化(以下、H2A K119ub)は、転写抑圧およびDNA修復18、19、20に関与する重要な翻訳後修飾である。 21、22。H2A K119ubは、エピジェネティック情報の維持に重要な役割を果たし、ショウジョウバエからヒトへの高度に保存されているポリコム抑圧複合体1(PRC1)によって触媒される。正規PRC1は、特に、上記のユビキチン化イベント22、23を担うコアE3ユビキチンリゲス複合体であるリング1BおよびBMI1によって構成される。ショウジョウバエでは、H2Aモノビキチン化(哺乳類のH2A K119ubに相当するH2A K118ub)は、ポリコム抑圧DUB(PR-DUB)複合体24を形成する追加のセックスコーム(ASX)と相互作用するDUBカリプソによって逆転される。カリプソの哺乳類のオルソログ、BAP1は、様々なヒト悪性腫瘍25、26、27、28、および様々なヒト悪性腫瘍において削除または不活性化された腫瘍抑制剤である。 29歳,30歳,31歳,32歳,33.BAP1は、小プラズム網膜33、34、35、36、核およびカルシウムシグナル伝達媒介アポトーシスにおけるDNA依存的プロセスを調節する。37歳,38歳,39歳,40歳,41歳,42.BAP1は、特にASXL1、ASXL2およびASXL3(ASXLs)、ASX38、43の3つのオルソログを含むマルチサブユニットタンパク質複合体を組み立てる。AsxLsは、DEUビクチネーゼアダプター(DEUBAD)ドメインを使用し、ASXMドメインとも呼び、BAP1 DUB活性35、36、44を刺激する。したがって、APLはクロマチンにおけるBAP1 DUB活性を調整する上で重要な役割を果たし、より広範に腫瘍抑制機能を果たす。
ユビキチン化およびデュビキチン化プロセスを研究するいくつかの方法が存在します。.特に、細菌から精製されたタンパク質を用いて生化学的アッセイは、特定の基質からのユビキチンの直接ユビキチン化または除去を実証する上で非常に強力なままである。これらの実験は、最小限の複合体の要件の決定、反応運動学の決定、構造/機能関係の定義、病理学的影響の理解などのパラメータの範囲を調査するために行うことができます。遺伝子の突然変異。ここでは、精製成分を用いてクロマチン基質に対してユビキチン化およびデュービキチン化反応を行うプロトコルを提供する。モデルシステムとして、ヌクレオソームH2Aタンパク質のインビトロユビキチン化およびデュビキチン化が提示される。RING1B/BMI1およびBAP1/DEUBADの最小限の複合体で組み立てられた細菌精製タンパク質は、それぞれヌクレオソームH2Aのユビキチン化またはデュビキチン化に使用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
目的のタンパク質に対して、インビトロユビキチン化およびデュビキチン化アッセイを確立することにはいくつかの利点があります。これらのアッセイは、(i)最適な条件を確立し、これらの反応に対する最小限の要件を定義し、(ii)酵素運動および生化学的定数を決定し、(iii)これらの反応に影響を与える可能性のある補因子または阻害剤の役割を定義する、(iv)相互作用インタフェースを同定…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、技術支援のためにダイアナ・アジャウドに感謝します。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(2015-2020)、ゲノムケベック(2016-2019)、ゲノムカナダ(2016-2019)からE.B.A.E.B.A.への助成金によって支援されました。L.M.とN.S.K.はFRQ-Sから博士号を取得しています。H.Bは、高等教育省とチュニジアの科学研究とコール財団から博士号を取得しました。
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
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