In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones
Summary
Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.
Abstract
Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in verschiedenen Signalwegen spielt und insbesondere an der Koordination von Chromatinfunktion und DNA-assoziierten Prozessen beteiligt ist. Diese Modifikation beinhaltet eine sequenzielle Wirkung mehrerer Enzyme, einschließlich E1-Ubiquitin-aktivierend, E2-Ubiquitin-konjugating und E3-Ubiquitin-Ligase und wird durch Deubiquitinasen (DUBs) umgekehrt. Ubiquitination induziert Abbau von Proteinen oder Veränderung der Proteinfunktion einschließlich Modulation der enzymatischen Aktivität, Protein-Protein-Interaktion und subzelluläre Lokalisierung. Ein entscheidender Schritt beim Nachweis der Proteinubiquitination oder Deubiquitination ist die Durchführung von In-vitro-Reaktionen mit gereinigten Komponenten. Effektive Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen könnten stark durch die verschiedenen verwendeten Komponenten, Enzym-Co-Faktoren, Pufferbedingungen und die Art des Substrats beeinflusst werden. Hier bieten wir Schritt-für-Schritt-Protokolle zur Durchführung von Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen. Wir veranschaulichen diese Reaktionen mit minimalen Komponenten der Maus Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1 und RING1B, einer E3-Ubiquitinligase, die Denton H2A auf Lysin 119 monoubiquitiniert. Die Deubiquitination von nukleosomaler H2A erfolgt mit einem minimalen Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) Komplex, der durch die menschliche Deubiquitinase BAP1 und die DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) Domäne seines Co-Faktors ASXL2 gebildet wird. Diese Ubiquitination/Deubiquitination Assays können im Kontext entweder rekombinanter Nukleosomen durchgeführt werden, die mit bakteriellen gereinigten Proteinen oder einheimischen Nukleosomen, die aus Säugetierzellen gereinigt werden, rekonstituiert wurden. Wir weisen auf die Feinheiten hin, die einen erheblichen Einfluss auf diese Reaktionen haben können, und schlagen vor, dass die allgemeinen Prinzipien dieser Protokolle rasch an andere E3-Ubiquitinligasen und Deubiquitinasen angepasst werden können.
Introduction
Ubiquitination ist eine der am besten erhaltenen post-translationalen Modifikationen und ist entscheidend für eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Hefe, Pflanzen und Wirbeltiere. Ubiquitination besteht aus der kovalenten Anhaftung von Ubiquitin, einem hochkonservierten 76-Aminosäure-Polypeptid, an Zielproteinen und erfolgt in drei aufeinanderfolgenden Schritten mit drei Enzymen, d.h. E1-aktivierend, E2-konjugierend und E3-Ligase1, 2,3. Diese posttranslationale Modifikation spielt eine zentrale Rolle in einem breiten Spektrum biologischer Prozesse. Tatsächlich bilden die E3-Ligasen, die die Spezifität der Reaktion liefern, eine große Überfamilie von Enzymen und sind die am häufigsten vorkommenden Enzyme des Ubiquitinsystems4,5,6. Die nachgelagerten Wirkungen der Proteinubiquitination hängen von der Art der Modifikation ab: Monoubiquitination, Multimonoubiquitination und lineare oder verzweigte Polyubiquitination. Monoubiquitination ist selten mit proteasomaler Degradation verbunden, aber stattdessen ist diese Modifikation bei der Vermittlung verschiedener Signalereignisse beteiligt. Polyubiquitination beinhaltet das N-Terminal oder die Lysin-Rückstände im Ubiquitin-Molekül selbst, und das Schicksal eines polyubiquitinierten Proteins hängt davon ab, welche Rückstände an der Ubiquitin-Kettenverlängerung beteiligt sind. Es ist seit langem bekannt, dass Polyubiquitination durch Lysin 48 von Ubiquitin vermittelt proteasomal Abbau induziert. Im Gegenteil, Polyubiquitination über Lysin 63 von Ubiquitin ist oft mit Proteinaktivierungassoziiert 7,8,9. Ähnlich wie bei anderen wichtigen posttranslationalen Modifikationen ist die Ubiquitination reversibel und die Ubiquitinentfernung von Proteinen wird durch spezifische Proteasen, die als Deubiquitinasen (DUBs) bezeichnet werden, gewährleistet, die sich als wichtige Regulatoren zellulärer Prozesse herauskristallisiert haben. 2 , 10. Wichtig ist, dass viele DUBs hochspezialisiert sind und durch Deubiquitination spezifische Substrate regulieren, was darauf hindeutet, dass ein feines Gleichgewicht zwischen Ubiquitination und Deubiquitination für die Proteinfunktion entscheidend ist. E3s und DUBs bilden zusammen mit den Proteasomenabbaumaschinen und Zubehörfaktoren das Ubiquitin Proteasome System (UPS, mit >1200 Genen), das wichtige Signalwege reguliert, von denen einige mit Zellwachstum und -proliferation verbunden sind, Zellschicksalsbestimmung, Differenzierung, Zellmigration und Zelltod. Wichtig ist, dass die Deregulierung mehrerer Signalkaskaden mit Ubiquitination Tumorgenese und Neurodegenerationerkrankungen5,11,12,13 , 14.
Ubiquitination spielt eine allgegenwärtige Rolle in der Chromatinbiologie und DNA-abhängigen Prozessen15,16,17. Zum Beispiel ist die Monoubiquitination des Histones H2A auf Lysin 119 (im Folgenden H2A K119ub) eine kritische posttranslationale Modifikation, die an der Transkriptionsrepression und DNA-Reparatur beteiligt ist18,19,20, 21,22. H2A K119ub wird durch den Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) katalysiert, der eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung epigenetischer Informationen spielt und von Drosophila bis zum Menschen hochkonserviert ist. Canonical PRC1 besteht insbesondere aus dem RING1B und BMI1, die der Kern Komplex E3 ubiquitin ligase sind, der für das oben erwähnte Ubiquitinationsereignis22,23verantwortlich ist. In Drosophilawird die H2A-Monoubiquitination (H2A K118ub, die H2A K119ub bei Säugetieren entspricht) durch den DUB Calypso umgekehrt, der mit Additional Sex Comb (ASX) interagiert und den Polycomb-repressiven DUB (PR-DUB) Komplexbildet 24. Der Säugetierortholog von calypso, BAP1, ist ein Tumorsuppressor, der bei verschiedenen menschlichen Malignomen gelöscht oder inaktiviert wurde25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 reguliert DNA-abhängige Prozesse im Zellkern und Calcium-Signal-vermittelte Apoptose am endoplasmatischen Retikulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 montiert Multi-Subunit-Proteinkomplexe, die Transkriptionsregler, insbesondere ASXL1, ASXL2 und ASXL3 (ASXLs), drei Orthologues von ASX38,43enthalten. ASXLs verwenden die Domäne DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), auch ASXM-Domäne, um die BAP1 DUB-Aktivität35,36,44zu stimulieren. Daher spielen ASXLs eine wichtige Rolle bei der Koordination der BAP1 DUB-Aktivität bei Chromatin und allgemeiner seiner Tumorsuppressorfunktion.
Es gibt mehrere Methoden, um Ubiquitination und Deubiquitination Prozesse zu studieren. Insbesondere biochemische Assays mit Proteinen, die von Bakterien gereinigt werden, sind nach wie vor sehr mächtig, wenn es um die direkte Ubiquitinierung oder Entfernung von Ubiquitin aus bestimmten Substraten geht. Diese Experimente können durchgeführt werden, um eine Reihe von Parametern zu untersuchen, wie z. B. die Bestimmung der Anforderung von minimalen Komplexen, die Bestimmung der Reaktionskinetik, die Definition von Struktur-/Funktionsbeziehungen und das Verständnis der Auswirkungen pathologischer Genmutationen. Hier bieten wir Protokolle zur Durchführung von Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen auf Chromatinsubstraten mit gereinigten Komponenten. Als Modellsystem wird in vitro Ubiquitination und Deubiquitination von nukleosomalem H2A-Protein vorgestellt. Bakteriengereinigte Proteine, die in minimalen Komplexen von RING1B/BMI1 und BAP1/DEUBAD zusammengesetzt sind, werden zur Ubiquitination bzw. Deubiquitination von nukleosomalem H2A verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere Vorteile der Etablierung robuster In-vitro-Ubiquitination und Deubiquitination Assays für Proteine von Interesse. Diese Assays können verwendet werden, um: (i) optimale Bedingungen zu schaffen und minimale Anforderungen für diese Reaktionen zu definieren, (ii) enzymatische kinetische und biochemische Konstanten zu bestimmen, (iii) die Rolle von Kofaktoren oder Inhibitoren zu definieren, die diese Reaktionen beeinflussen können, (iv) Identifizierung von Wechselwirkungsschnittstellen, (v) Untersuchung d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Diana Adjaoud für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) und Genome Canada (2016-2019) an E.B.A. E.B.A. unterstützt, der ein leitender Wissenschaftler des Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S) ist. L.M und N.S.K. haben ein Promotionsstipendium der FRQ-S. H.B. erhielt ein Promotionsstipendium des Ministeriums für Hochschulbildung und der wissenschaftlichen Forschung Tunesiens und der Cole Foundation.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
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