Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Ubiqitinering og Deubiquitination analyser av Nucleosomal Histoner

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

Ubiqitinering er en post-translational modifikasjon som spiller viktige roller i cellulære prosesser og er tett koordinert av deubiquitination. Defekter i begge reaksjonene ligger til grunn menneskelige patologi. Vi tilbyr protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjon in vitro ved hjelp av renset komponenter.

Abstract

Ubiqitinering er en post-translational modifikasjon som spiller viktige roller i ulike signalering veier og er spesielt involvert i samordning av kromatin funksjon og DNA-assosiert prosesser. Denne endringen innebærer en sekvensiell handling av flere enzymer inkludert E1 ubiquitin-aktivering, E2 ubiquitin-bøye og E3 ubiquitin-ligase og reverseres av deubiquitinases (DUBs). Ubiqitinering induserer degradering av proteiner eller endring av protein funksjon inkludert modulering av enzymatisk aktivitet, protein-protein interaksjon og subcellulære lokalisering. Et kritisk skritt i å demonstrere protein ubiqitinering eller deubiquitination er å utføre in vitro reaksjoner med renset komponenter. Effektive ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner kan bli sterkt påvirket av de ulike komponentene som brukes, enzym co-faktorer, buffer forhold, og arten av underlaget.  Her gir vi trinn-for-trinn protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner. Vi illustrerer disse reaksjonene ved hjelp av minimale komponenter av musen Polycomb undertrykkende Complex 1 (PRC1), BMI1, og RING1B, en E3 ubiquitin ligase som monoubiquitinates histone H2A på lysin 119. Deubiquitination av nucleosomal H2A utføres ved hjelp av en minimal Polycomb undertrykkende Deubiquitinase (PR-DUB) kompleks dannet av den menneskelige Deubiquitinase BAP1 og DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domenet til co-Factor ASXL2. Disse ubiqitinering/deubiquitination analysene kan gjennomføres i sammenheng med enten rekombinant nucleosomes tilberedt med bakterier-renset proteiner eller innfødte nucleosomes renset fra pattedyrceller. Vi fremhever vanskelighetene som kan ha en betydelig innvirkning på disse reaksjonene, og vi foreslår at de generelle prinsippene for disse protokollene raskt kan tilpasses andre E3-ubiquitin ligases og deubiquitinases.

Introduction

Ubiqitinering er en av de mest bevarte post-translational modifikasjoner og er avgjørende for et bredt spekter av organismer, inkludert gjær, planter og virveldyr. Ubiqitinering består av kovalente feste av ubiquitin, en svært bevart 76 aminosyre polypeptid, å målrette proteiner og forekommer i tre sekvensielle trinn som involverer tre enzymer, dvs., E1-aktivering, E2-bøye og E3 ligase1, 2,3. Dette post-translational modifikasjon spiller sentrale roller i et bredt spekter av biologiske prosesser. Faktisk er E3 ligases, som gir spesifisitet av reaksjonen, utgjør en stor overfamilie av enzymer og er de mest tallrike enzymer i ubiquitin system4,5,6. Den nedstrøms effekten av protein ubiqitinering avhenger av innholdet i endringen: monoubiquitination, multi-monoubiquitination, og lineær eller utvidet polyubiquitination. Monoubiquitination er sjelden forbundet med proteasomal degradering, men i stedet denne endringen er involvert i formidling ulike signalnettverk hendelser. Polyubiquitination involverer N-Terminal eller lysin rester i ubiquitin molekyl selv, og skjebnen til en polyubiquitinated protein avhenger av hvilke rester er involvert i ubiquitin kjeden forlengelse. Det har lenge vært kjent at polyubiquitination formidlet av lysin 48 av ubiquitin induserer proteasomal degradering. Tvert imot, polyubiquitination via lysin 63 av ubiquitin er ofte forbundet med protein aktivisering7,8,9. I likhet med andre viktige post-translational modifikasjoner, ubiqitinering er reversibel og ubiquitin fjerning av proteiner er sikret ved spesifikk proteaser betegnes deubiquitinases (DUBs), som har dukket opp som viktige regulatorer av cellulære prosesser 2 andre priser , 10. viktigere, mange DUBs er høyt spesialiserte, og regulerer gjennom deubiquitination, spesifikke underlag, noe som indikerer at en fin balanse mellom ubiqitinering og deubiquitination er kritisk for protein funksjon. E3s og DUBs, sammen med proteasomet ned brytnings maskiner og tilbehørs faktorer, danner Ubiquitin Proteasomet system (UPS, med > 1200 gener) som regulerer store signal veier, hvorav flere er forbundet med cellevekst og spredning, celle skjebne besluttsomhet, differensiering, celle migrasjon, og celle død. Viktigere, dereguleringen av flere signalering kaskader involverer ubiqitinering fremmer tumorigenesis og neurodegeneration sykdommer5,11,12,13, 14i det.

Ubiqitinering spiller gjennomgripende roller i kromatin biologi og DNA-avhengige prosesser15,16,17. For eksempel, monoubiquitination av histone H2A på lysin 119 (heretter H2A K119ub) er en kritisk post-translational modifikasjon involvert i transcriptional undertrykkelse og DNA reparasjon18,19,20, 21,22. H2A K119ub er katalysert av Polycomb undertrykkende Complex 1 (PRC1), som spiller en nøkkelrolle i opprettholdelsen av epigenetic informasjon og er svært bevart fra Drosophila til mennesker. Kanonisk PRC1 er konstituert spesielt av RING1B og BMI1, som er kjernen E3 ubiquitin ligase kompleks ansvarlig for ovennevnte ubiqitinering hendelse22,23. I Drosophila, H2A MONOUBIQUITINATION (H2A K118ub som tilsvarer H2A K119ub i mammalians) er reversert av dub Calypso, som samhandler med ytterligere sex kam (ASX) danner Polycomb-undertrykkende dub (pr-DUB) kompleks24. Pattedyr ortholog av Calypso, BAP1, er en svulst Suppressor slettet eller deaktivert i ulike menneskelige ondartet25,26,27,28, 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33. BAP1 regulerer DNA-avhengige prosesser i kjernen og kalsium-signalering-mediert apoptose på endoplasmatiske retikulum33,34,35,36, 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 42. BAP1 samler multi-delenhet protein komplekser inneholder transkripsjon regulatorer spesielt ASXL1, ASXL2 og ASXL3 (ASXLs), tre orthologues av ASX38,43. ASXLs bruke DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domene, også kalt ASXM domene, for å stimulere BAP1 dub aktivitet35,36,44. Derfor ASXLs spille viktige roller i å koordinere BAP1 DUB aktivitet på kromatin og mer generelt sin tumor Suppressor funksjon.

Det finnes flere metoder for å studere ubiqitinering og deubiquitination prosesser. Biokjemiske analyser som bruker proteiner renset fra bakterier er fortsatt svært kraftige i å demonstrere direkte ubiqitinering av, eller fjerning av ubiquitin fra, spesifikke underlag. Disse eksperimentene kan gjennomføres for å undersøke en rekke parametre som å bestemme kravet om minimale komplekser, bestemme reaksjoner Kinetics, definere struktur/funksjon relasjoner, og forstå virkningen av patologisk genmutasjoner. Her gir vi protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner på kromatin underlag med renset komponenter. Som et modell system, in vitro ubiqitinering og deubiquitination av nucleosomal H2A protein er presentert. Bakterier-renset proteiner montert i minimale komplekser av RING1B/BMI1 og BAP1/DEUBAD brukes for ubiqitinering eller deubiquitination av nucleosomal H2A, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. GSH-agarose affinitet rensing av GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin Ligase kompleks

  1. Bruk pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) bakterie uttrykk til å transformere BL21 (DE3)-bakterier (se tabell over materialer)23. Denne konstruksjonen gjør at uttrykket av murine RING1B domene 1-159 smeltet til BMI1 domene 1-109 med GST tag i pGEX-6P-2 ryggrad.
  2. Utføre en natt starter kultur av vaksinere RIL-bakterier uttrykker GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109 AA) i 20 mL LB buljong medium i nærvær av 100 μg/mL Ampicillin og 50 μg/mL kloramfenikol. Ruge ved risting ved 37 ° c over natten. På neste dag, legge til Start kulturen til en 1 L kolbe inneholder 500 mL fersk LB buljong medium (1/26 fortynning) med Ampicillin og ruge kulturen i shaker ved 37 ° c for 2 til 4 h.
  3. I løpet av inkubasjonstiden måler du OD ved 600 NM med en spektrofotometer. Når bakterie kulturen når 0,6 OD enheter ved 600 NM, ta en 1 mL alikvot i en 1, 5 mL tube som ikke-indusert prøven. Tilsett 400 μM av isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTH) til 1 L kulturen for å indusere protein uttrykk. Ruge bakterier ved 25 ° c for 6 t til over natten.
    1. Sentrifuger 1 mL alikvoter ved 14 000 x g for 30 s, kast supernatanten, resuspend pellet i 200 ΜL av Laemmli prøve buffer, og holde for SDS-side og Coomassie blå analyse av protein induksjon.
  4. Overfør den induserte bakterie kulturen fra flasken til en ren sentrifugering flaske og spinn ned ved 3 500 x g i 15 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend pellet med 40 mL kald PBS og snurr ned ved 3 500 x g i 15 min ved 4 ° c.
  5. Kast supernatanten og fryse pellet ved-80 ° c eller gå videre til neste trinn. Hvis proteinene er indusert ved forventet molekylvekt, går du videre til neste trinn.
  6. Resuspend bakterie pellet i 25 mL iskald lyse Rings buffer A (50 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP40, 1 mm PMSF, 0,5 mm DTT og 1/100 protease-cocktail som inneholder AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin og Pepstatin A). Kontroller at alle bakteriene pellet er resuspendert. PMSF og anti-protease cocktail må være fersk lagt til lyseringsbuffer, bare på tidspunktet for bakterier lyse.
    Forsiktig: Alltid holde prøven på isen.
    Merk: Lysozyme på 100 μg/mL kan tilsettes for å forbedre bakterie lyse.
  7. Ruge bakteriene lysat på isen i 15 min. Bruk en sonde sonicator og sonikere ved 70% utgangs amplitude for 30 s (4 – 5x), og deretter sentrifuge ved 21 000 x g i 20 min ved 4 ° c.
    Forsiktig: Under sonikering, holde alltid prøvene på isen.
  8. I løpet av sentrifugering, ta 500 μL pakket GSH-agarose perler (50% slurry) i en 15 mL rør og tilsett 10 mL buffer a uten PMSF og anti-proteaser. Bland kort og spinn på 2 500 g i 3 min ved 4 ° c, Gjenta dette vasketrinn to ganger og holde perlene på isen.
  9. Etter bakteriell lysat sentrifugering, samle supernatanten og overføre den til en 50 mL konisk rør. Ta en alikvot på 100 μL som en total lysat og tilsett 100 μL av 2x Laemmli prøve buffer for SDS-PAGE og Coomassie blå analyse.
  10. Filtrer lysat gjennom 0,45 μm pore sprøyte filter og bland det med GSH perler. Ruge ved 4 ° c med risting i 5 h. snurr ned perlene ved 2 500 x g i 3 min, fjern og lagre supernatanten som renner gjennom. Vask proteiner-GSH bundet perler 6 ganger (5 mL hver) med buffer A inneholder anti-protease cocktail og PMSF.
  11. Etter den siste vasken, Overfør perlene sammen med 10 mL buffer i en tom kromatografi kolonne, tilsett 1,5 mL buffer A inneholdende 25 mm glutation, og samle eluering ved tyngdekraften til 1,5 ml mikrorør. Gjenta prosedyren for eluering 4 ganger.
    Merk: Glutation lagerløsning er forberedt på 200 mM konsentrasjon i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
  12. Ta en alikvot på 10 μL fra hver av de 4 elutions og tilsett 10 μL av 2x Laemmli prøve buffer. Disse prøvene vil bli brukt for SDS-PAGE og Coomassie blå analyse for å bestemme tilstedeværelsen og renheten av renset proteiner.
    Merk: Etter siste eluering, hold perlene i buffer ved 4 ° c for resirkulering og fremtidig bruk.
  13. Velg eluert fraksjoner som viser fornuftige mengder av renset proteiner for videre analyse. Lag små alikvoter av preparatet. Oppbevar renset proteiner i-80 ° c. Protein konsentrasjonen vil vanligvis variere fra 0,5 μg til 2 μg per μL, og prøvene kan lagres i denne tilstanden.
  14. Valgfritt: Konsentrere prøven eller endre buffer ved hjelp av en 10K sentrifugal Filterenhet

2. rensing av BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase Complex

  1. Bruk pET30a +-His-BAP138 og PDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 bakteriell uttrykk konstruerer å transformere BL21 (DE3) RIL bakterier for produksjon av HIS-BAP1 og MBP-DEUBAD hhv.
  2. Utfør to separate overnatter starter kulturer av incubating hans-BAP1 og MBP-DEUBAD (ASXL2) uttrykker bakterier i 20 ml lb buljong av Ampicillin medium inneholdende 50 mikrogram/ml kloramfenikol og tilsvarende antibiotika for hver plasmider, 100 μg/ mL kanamycin eller 100 μg/mL av Ampicillin hhv. Plasser på shaker ved 37 ° c.
  3. Utfør trinn 1.3 – 1,6.
  4. Resuspend bakterier pellets i 25 mL iskald lyseringsbuffer B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-Mercaptoethanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF og 1/100 anti-protease cocktail). Bland like volumer av HIS-BAP1 med MBP-DEUBAD lysater og ruge på isen i 15 min. Sonikere og deretter sentrifuger lysat som indikert i protokoll 1 (trinn 9).
    1. Under sentrifugering, forberede 500 μL pakket ni-NTA agarose perler (50% slurry) ved å vaske dem tre ganger med buffer B uten PMSF og anti-protease cocktail.
  5. Etter bakteriell lysat sentrifugering, samle supernatanten og overføre den til en 50 mL konisk rør. Ta en alikvot på 100 μL som en total lysat og tilsett 100 μL av 2x Laemmli prøve buffer for SDS-PAGE og Coomassie blå analyse.
  6. Filtrer lysat gjennom 0,45 μm pore sprøyte filter og bland det med ni-NTA perler. Ruge ved 4 ° c med risting i 5 h. snurr ned perlene ved 2 500 x g i 3 min, fjern og lagre supernatanten som renner gjennom.
    1. Vask perlene 6 ganger (5 mL hver) med buffer B som inneholder 20 mm 1, 3-Diaza-2, 4-Cyclopentadiene (Imidazole).
      Merk: Lag en lagerløsning på 2 M imidazole ved pH 7,3.
  7. Etter den siste vasken, Overfør perlene med 10 mL buffer i en tom kromatografi kolonne, tilsett 1 mL buffer B som inneholder 200 mm Imidazole og samle eluering ved tyngdekraften til 1,5 ml mikrorør som inneholder 10 μL DTT (500 mm) og 2 μL EDTA (500 mm , pH: 8). Gjenta prosedyren eluering 4 ganger. Ta 10 μL av hver eluering brøk og tilsett 10 μL av 2x Laemmli prøve buffer for SDS-PAGE og Coomassie blå analyse. Pool ønsket eluert fraksjoner.
    Merk: Oppbevar perlene i buffer ved 4 ° c for resirkulering og fremtidig bruk.
  8. Fortynne eluert kompleks 3 ganger med buffer C (50 mM Tris pH 7,3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, og 1/100 protease inhibitor cocktail) før inkubasjons med amylose agarose perler.
    1. Forbered amylose agarose perler (500 μL pakket) ved å vaske dem 2 ganger med buffer C uten å legge PMSF og anti-protease cocktail. Tilsett perlene i den fortynnede eluering og ruge over natten ved 4 ° c.
  9. Sentrifuger på 2 500 x g i 3 min og holde flyten gjennom. Vask proteiner-grensene perler med 5 mL buffer C (5-6 ganger).
  10. Hold renset hans-BAP1/MBP-DEUBAD kompleks på amylose agarose perler i buffer D (50 mm HEPES pH 8,0, 50 mm NaCl, 10% glyserol, og 1 mm DTT) og lagre ved-80 ° c. Ta 20 μL av perlene brøk (50% perler oppløsning) og tilsett 20 μL av 2x Laemmli prøve buffer for SDS-side og Coomassie blå analyse.

3. rensing av Nucleosomes fra HEK293T Cells

  1. Kultur HEK293T celler i komplett Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 5% nyfødte kalv serum (NBS), 2 mM L-glutamin, og 1% penicillin/Streptomycin.
  2. Plate rundt 12 x 106 HEK293T celler i 20 ml av komplette medier per 15 cm kultur parabolen en dag før transfeksjoner (10 retter ble brukt). Før transfeksjoner endrer du cellens medium til 12 mL serum fritt medium og transfect cellene med 21 μg av pCDNA-Flag-H2A ved hjelp av 63 μL av polyethylenimine (PEI) ved 1 mg/mL36. Endre for å fullføre medium 12 h senere.
  3. Tre dager etter transfeksjoner, vaske cellene med 15 mL iskald PBS (to ganger) og høste dem i 3 mL iskald PBS bruker en celle skraper. Sentrifuger ved 2 100 x g i 8 min ved 4 ° c. Kast PBS og Fortsett til lyse Rings trinnet eller Frys celle pellet ved-80 ° c.
  4. Resuspend celle pellet i ca 10 bind av buffer E (50 mm Tris-HCl pH 7,3, 420 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm MgCl2, 1 mm PMSF, 1/100 protease inhibitor cocktail, og 20 mm av N-methylmaleimide (NEM)) og ruge på isen i 20 min. legge til N-methylmaleimide (NEM) er avgjørende for å hemme DUBs som co-renser med nucleosomes.
  5. Etter sentrifugering ved 3 000 x g i 5 min, kast supernatanten og resuspend kromatin pellet i 10 bind av buffer E. Bland ved å vende og sentrifuger ved 3 000 x g i 5 min.
    1. Gjenta vaske trinnet en annen gang ved hjelp av buffer E og to ganger ved hjelp av buffer F "MNase buffer" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 2 mm MgCl2, 1 mm CaCl2, 0,3 M sukrose, 0,1% np-40, 1 mm PMSF, og 1/100 protease inhibitor en cocktail).
      FORSIKTIG: pellet vil flyte under vask og sentrifugering.
  6. Resuspend kromatin i 5 mL buffer F og behandle pellet med Micrococcal nuklease (3 U/ml i 10 min ved romtemperatur).
    Merk: Reaksjonen kan bli hjulpet ved å blande ved hjelp av en Dounce Homogenisator.
  7. Etter inkubasjons, ta en 40 μL alikvot av blandingen for analyse av nucleosomal DNA fragmenter. Bland denne alikvot med 40 μL av fenol/kloroform og 20 μL av 6 ganger DNA-lasting buffer, Vortex, spin ved 18 000 x g i 2 minutter, og Last DNA på en 2% agarose gel.
    1. Når DNA er overveiende en 147 BP fragment tilsvarende mononucleosomes, stoppe reaksjonen ved å legge 5 mM EDTA ved endelig konsentrasjon.
  8. Etter sentrifugering ved 21 000 x g i 20 min ved 4 ° c, ruge den oppløselige kromatin fraksjonen med anti-Flag harpiks over natten ved 4 ° c. Vask perlene med 6 ganger buffer G (50 mm Tris-HCL, pH 7,3, 5 mm EDTA, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm PMSF, 1 mm DTT, 1/100 protease hemmere cocktail).
  9. Overfør perlene med 5 mL buffer G inn i en tom kromatografi-kolonne. Eluere den perler-bundet nucleosomes med 200 μg/mL av flagg eluering peptid. Bruk en eluering buffer bestående av buffer G som inneholder 200 μg/ml flagg eluering peptider (se tabell over materialer) og 1/5 (Vol: Vol) 1 M Tris, pH 8,0. Eluere nucleosomes 3x med 260 μL flagg eluering buffer (2 h hver eluering).
  10. Test de 3 elutions ved å ta en alikvot for kloroform ekstraksjon og Last DNA i en 2% agarose gel. Ta 10 μL av hver eluering brøk og tilsett 10 μL av Laemmli prøve buffer 2x for SDS-PAGE og Coomassie blå analyse og Last hver eluering for Western Blot deteksjon av ubiquitinated H2A. Oppbevar eluering ved-80 ° c. Generelt gir rensing fra humane celler mindre mengder proteiner enn bakterier, med konsentrasjoner fra 0,1 til 0,5 μg/μL.

4. Nucleosome Ubiqitinering analysen bruke BMI1/RING1B E3 Ubiquitin Ligase Complex

  1. Sentrifuger nucleosomes gjennom 10K pore 0,5 mL sentrifugal filtre for å endre underlaget fra eluering buffer til reaksjons buffer H (25 mm Tris, pH 7,5; 10 mm MgCl2, og 5 mm ATP). Alternativt kan kommersielt tilgjengelige nucleosomes brukes for analysen.
    Merk: Endring av substrat fjærings løsning til reaksjonsbuffer sikrer reproduserbarhet og forhindrer potensiell E3 ligase hemming av forbindelser som finnes i Flag eluering-blandingen.
  2. Ruge 1 μg av nucleosomes i 40 til μL totalt volum av buffer H. Legg UB aktivere enzym (UBE1) (250 ng), UB (50 ng/μL) og E2 UB-bøye enzymer (672 ng), og 1 mikrogram BMI1/RING1B E3 ubiquitin ligase kompleks. Ruge reaksjonen i 3 timer ved 37 ° c med sporadiske risting.
    Merk: Flere kontroller kan gjennomføres parallelt inkludert Utelat, E1, E2, E3, ATP og ubiquitin. Dette sikrer spesifisitet for ubiqitinering reaksjonen.
  3. Stopp reaksjonen ved å legge 40 μL av 2x Laemmli prøve buffer og analysere histone H2A K119 ubiqitinering av SDS-PAGE og vestlige blotting, i henhold til standard prosedyrer. Bruk enten anti-H2A eller anti-H2A K119ub antistoffer (se tabell av materialer).

5. in vitro Nucleosomal H2A DUB analysen bruke BAP1/DEUBAD

  1. Bruk renset nucleosomes for in vitro deubiquitination analysen. Resuspend på 100 – 500 ng av nucleosomes i 40 μL buffer i (50 mm Tris-HCL, pH 7,3, 1 mm MgCl2, 50 mM NACL og 1 mm DTT). Tilsett 1 mikrogram BAP1 bakterier-renset hans-BAP1 og MBP-DEUBAD. Utfør deubiquitination reaksjonen i 3 timer ved 37 ° c med sporadisk risting.
  2. Stopp in vitro-reaksjonen ved å tilsette 40 μL av 2x Laemmli buffer og analyser ved proteinimmunoblotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GST-BMI1 og RING1B proteiner er godt produsert i bakterier og kan lett utvinnes i løselig brøk. Figur 1a viser en Coomassie blå farging for en typisk rensing av gst-BMI1-RING1B-komplekset. GST-BMI1 og RING1B-båndene migrerer ved forventet molekylvekt, ~ 45 kDa og ~ 13 kDa hhv. Spesielt E3 ligase komplekset er svært homogen med svært lave nivåer av bakterier proteiner forurensninger og/eller fornedrelse produkter. Videre er støkiometri av renset komplekset optimal, som med en molar ratio på 1:1, er bandet intensiteten av GST-RING1B protein ventes å være to til tre ganger sterkere enn for BMI1. På samme måte resulterte også rensing av hans-BAP1/MBP-DEUBAD kompleks i relativt svært homogene forberedelser med bånd på ~ 90 kDa og ~ 55 kDa, henholdsvis (figur 1B). Den tandem affinitet rensing av BAP1 og DEUBAD, gjennom nikkel-agarose og amylose-agarose henholdsvis sikrer og tilstrekkelig støkiometri og fjerning av frie BAP1 fra renset komplekse. På den annen side, renset nucleosomal brøkdel er i hovedsak komponert av 147bp band som indikerer tilstedeværelsen av svært beriket mononucleosomal brøkdel (figur 1C). Coomassie blå farging av disse renset nucleosomes viser et typisk band mønster av de fire histone under enheter med støkiometriske mengder (figur 1d). Kommersielt tilgjengelige rekombinant mononucleosomes også vise lignende protein og DNA-mønstre når migrert på SDS-side og agarose gels hhv. Av notatet, monoubiquitinated former for H2A og Flag-H2A kan lett skilles på HEK293T-renset nucleosomes. Vi brukte rekombinant nucleosomes sammen med E1/E2/Ubiquitin/ATP og observert at ubiqitinering av histone H2A med BMI1-RING1B kompleks viser en tidsavhengig økning av ubiquitinated form av proteinet, mens nivåene av den ikke-modifiserte formen er samtidig redusert. Ubiqitinering reaksjonen er total, ettersom nesten alle H2A proteiner omdannes til H2A K119ub (figur 1e). På den annen side, deubiquitination analysen ble gjennomført på Native nucleosomes. Etter inkubasjons av disse nucleosomes med BAP1/DEUBAD, observerte vi en tidsavhengig reduksjon av H2A K119ub signal (figur 1F). Merk at to band av ubiquitinated H2A observert med anti-H2A K119ub tilsvarer transfekterte Flag-H2A og endogene H2A migrerer til ~ 30 kDa og ~ 25 kDa band hhv.

Figure 1
Figur 1: rensing, ubiqitinering og deubiquitination. (A) rensing av gst-RING1B-BMI1 proteiner og analyse ved hjelp av Coomassie blå farging. GST-RING1B-BMI1 ble produsert i bakterier og renset ved hjelp av GST affinitet perler. For å bekrefte rensing renhet og proteiner størrelse, elutions ble lastet på 15% SDS-side gel og beiset med Coomassie blå. Forskjellig mengde BSA brukes til å bestemme protein mengde. Den fargede gel ble skannet for å generere figuren. (B) rensing av MBP-DEUBAD/His-BAP1 kompleks. MBP-DEUBAD og hans-BAP1 ble produsert separat i bakterier. Etter lyse, MBP-DEUBAD og hans-BAP1 ble blandet og renset ved hjelp av nikkel og maltose perler. Den renset komplekset ble lastet på 8% SDS-side gel og beiset med Coomassie blå. (C) rensing av Mononucleosome etter MNase behandling. Kromatin fra HEK293T uttrykker pcDNA. 3 Flag-H2A ble ekstrahert og behandlet med MNase å generere og rense mononucleosomes. For å bekrefte genereringen av mononucleosome ble det tatt en brøkdel av kromatin for kloroform ekstraksjon og deteksjon av fenol under UV-lys. Lasting på 2% agarose gel avslører en typisk 147 base-pair DNA fragment indikasjon på mononucleosome. (D) renset mononucleosomes ble brukt for Coomassie blå farging. (E) in vitro-ubiqitinering av nucleosomes. Rekombinant nucleosomes ble inkubert ved 37 ° c med bakteriell renset E3 ubiquitin ligase dimer, GST-RING1B/BMI1 og E1/E2/ATP/Ubiquitin, for de angitte tider. H2A monoubiquitination (H2A K119ub) ble analysert av vestlige blotting. (F) Deubiquitination-ANALYSEN av H2A K119ub ved hjelp av BAP1/DEUBAD deubiquitinase-komplekset. In vitro deubiquitination analyser ble utført ved hjelp av bakterier renset hans-BAP1/MBP-DEUBAD og pattedyr renset nucleosomes. Reaksjonene ble gjort for de tiltalte tider og analysert av vestlige blotting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Kontroller og oversikt over protokollen. (A) renset pattedyr BAP1 eller dens katalysatorer død MUTANT (C91S) samt bakterier-RENSET rekombinant BAP1 ble brukt for H2A deubiquitination på nucleosomes. Nucleosomes inkubert med buffer alene eller med elutions innhentet fra mock rensing ble også inkludert som kontroller. (B) BAP1 ikke Deubiquitinate H2A K13/K15 hvis ubiqitinering er FORMIDLET av RNF168 E3 ligase. HEK293T celler var co-transfekterte med enten H2A K13R/K15R eller H2A K118R/K119R sammen med RNF168 å sikre ubiqitinering på K13/K15 rester. Den renset nucleosomes ble brukt for deubiquitination av BAP1 komplekser. Reaksjonen ble stoppet på forskjellige tidspunkter og utsatt for proteinimmunoblotting. (C) rensing av ikke-ubiquitinated og monoubiquitinated DEUBAD i KOMPLEKSE med BAP1 fra pattedyrceller. Den renset kompleks ble brukt for deubiquitination analysen på nucleosomal H2A K119ub. Reaksjonene ble gjort for de indikerte tid poeng og analysert av vestlige blotting. (D) BAP1 Deubiquitinates H2A K119ub in vivo. HEK293T celler var co-transfekterte med H2A eller H2A mutanter (H2A K118R, K119R, K118R/K119R eller K13R/K15R) sammen med BAP1 og ASXL2 konstruksjoner. To dager etter transfeksjoner, celler ble høstet for proteinimmunoblotting ved hjelp av indikerte antistoffer. (E) skjematisk fremstilling av den eksperimentelle arbeidsflyten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere fordeler ved å etablere robuste in vitro ubiqitinering og deubiquitination analyser for proteiner av interesse. Disse analysene kan brukes til å: (i) etablere optimale forhold og definere minimale krav til disse reaksjonene, (II) bestemme enzymatisk kinetisk og biokjemiske konstanter, (III) definere rollene til kofaktorer eller hemmere som kan påvirke disse reaksjonene, (IV) identifisere interaksjon grensesnitt, (v) teste effekten av kunstige eller sykdom-tilknyttede mutasjoner og (vi) etablere analysen forhold som kan videre brukes til å utvikle høy gjennomstrømming kjemiske screening analyser. Her er vi eksempler på disse analysene ved å beskrive hvordan vi utfører BMI1/RING1B-mediert H2A ubiqitinering og BAP1/ASXL-mediert H2A deubiquitination på nucleosomal underlag.

Ubiqitinering av histone H2A kan sammenfattet in vitro ved hjelp av minimale komponenter, da nesten fullstendig ubiqitinering av H2A kan observeres ved hjelp av BMI1-RING1B-kompleks. Av notatet, er denne reaksjonen utført på rekombinant nucleosomes. Disse har fordelen av å være fri fra andre histoner post-translational modifikasjoner som forekommer i pattedyrceller. Likevel kan ubiqitinering reaksjonen også effektivt gjennomføres på innfødte nucleosomes. Hvis ubiqitinering reaksjonen er svak, kan forholdet mellom enzymer kontra underlag økes for å observere optimal ubiquitin ligation. Av notatet, hvis deubiquitination reaksjoner eller interaksjon analysene skal gjennomføres etter substrat ubiqitinering, deretter ubiqitinering kan være direkte utført på perler-bundet underlag. Det ubiquitinated underlaget kan utvinnes ved å trekke ned og supernatanten som inneholder komponentene i den ubiqitinering reaksjonen kan kastes. Men når enzymatisk egenskaper skal etableres, enzymer må eluert og støkiometri av komponenter evaluert av størrelse eksklusjon kromatografi.

Den deubiquitination reaksjonen krever mindre komponenter enn ubiqitinering reaksjonen. Men rensing av DEUBAD alene generelt føre til protein nedbør. Viktigere, når DEUBAD er renset med BAP1, dette øker sterkt sin løselighet. Av notatet, foreslår vi gjennomføre deubiquitination analyser med ulike mengder av underlaget og enzym kompleks. Den deubiquitination reaksjonen kan bli hemmet av overflødig mengder av kromatin, som kan trolig forklares med økte konsentrasjoner av hemmere forbundet med nucleosomes. Vi observerte også deubiquitination med overskudd av gratis BAP1. Således, adskillige kontroller være nødt til å være inkludert som incubating nucleosomes med BAP1 alene (skikkelsen 2a). Det er også viktig å merke seg at noen DUBs kan co-rense med kromatin, og selv om vi behandler kromatin med NEM, kan DUBs bli delvis reaktivert følgende tillegg av DTT som reduserer katalysatoren cystein. I tillegg metalloproteinase DUBs kan også være til stede, og disse enzymene er ufølsom for NEM og er dermed ikke hemmet. Derfor bør flere kontroller inkluderes består av bare nucleosomes uten å legge enzymer og DUB katalysator død mutant (figur 2a). Av notatet, er spesifisitet av BAP1 DUB aktivitet mot H2A K119ub godt dokumentert og ble validert i våre analysen forhold. Vi renset fra HEK293T celler nucleosomes uttrykker enten H2A K118/K119R eller H2A K13/K15R. Uttrykk for RNF168 fører til en viktig ubiqitinering på K13/K15. BAP1 DUB aktivitet er observert bare på nucleosome som inneholder H2A K13/K15R tilsvarende H2A K119ub (figur 2b). En annen vurdering er at post-translational modifikasjoner som kan være kritisk for enzymatisk aktivitet er sannsynligvis ikke å være til stede i bakterielle proteiner. Således in vitro reaksjoner ved hjelp av komponenter renset fra pattedyrceller kan også betraktes som35. For eksempel, monoubiquitination av DEUBAD, en prosess observert i høyere Landplantenes, sterkt fremme deubiquitinase aktivitet av BAP135 (figur 2C). Dermed kan rensing av komponenter fra pattedyrceller også vurderes. I tillegg til in vitro-reaksjoner, er det mulig å overvåke BAP1 DUB aktivitet direkte i cellene etter transfeksjoner. For eksempel kan transfeksjoner av HEK293T-celler med H2A-konstruere gi et klart signal om H2A K119ub på grunn av dens overflod i celler. I disse forholdene, det meste av ubiqitinering skjer på K118/K119 rester, som mutasjon av disse nettstedene til Arginine føre til fullstendig fravær av H2A ubiqitinering (figur 2D). Co-uttrykker BAP1 og ASXL2 sammen med H2A gjør det mulig å konkludere på BAP1 DUB aktivitet i cellene. Men flere punkter må betraktes som overuttrykte kan føre til feilaktige resultater. Dermed disse eksperimentene må optimaliseres og godt kontrollert.

Oppsummert protokollene beskrevet her, sammenfattet i figur 2e, er grei, ikke krever en spesialisert infrastruktur eller eksperimentell oppsett, og kan skaleres opp til å produsere betydelige mengder modifisert nucleosomes for flere applikasjoner nedstrøms inkludert enzymatisk analyser, masse massespektrometri og protein-protein interaksjon analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Diana Adjaoud for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genova Quebec (2016-2019) og Genova Canada (2016-2019) til E.B.A. E.B.A. er seniorforsker i fonds de la Recherche du Québec-santé (FRQ-S). L. M og N.S.K. har et doktorgradsstipend fra FRQ-S. H. B hadde et doktorgradsstipend fra departementet for høyere utdanning og fra Scientific Research i Tunisia og Cole Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).

Tags

Biokjemi ubiqitinering deubiquitination E3 ubiquitin ligase PRC1 deubiquitinase PR-DUB kromatin BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
In vitro Ubiqitinering og Deubiquitination analyser av Nucleosomal Histoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O.,… More

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O., Sen Nkwe, N., Barbour, H., Iannantuono, N. V. G., Boubekeur, A., Daou, S., Affar, E. B. In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones. J. Vis. Exp. (149), e59385, doi:10.3791/59385 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter