Live beeldvorming en analyse van spiercontracties in Drosophila embryo
Summary
Hier presenteren we een methode om embryonale spiercontracties in Drosophila embryo’s op te nemen op een niet-invasieve en detail georiënteerde manier.
Abstract
Gecoördineerde spiercontracties zijn een vorm van ritmisch gedrag dat vroegtijdig wordt gezien tijdens de ontwikkeling van Drosophila -embryo’s. Neuronale sensorische feedback circuits zijn vereist om dit gedrag te beheersen. Het niet produceren van het ritmische patroon van weeën kan een indicatie zijn van neurologische afwijkingen. We ontdekten eerder dat defecten in eiwit-O-mannosylatie, een posttranslationele eiwit modificatie, de axon morfologie van sensorische neuronen aantasten en resulteren in abnormale gecoördineerde spiercontracties in embryo’s. Hier presenteren we een relatief eenvoudige methode voor het opnemen en analyseren van het patroon van peristaltische spiercontracties door Live beeldvorming van laat stadium embryo’s tot het punt van broedeieren, die we gebruikten om de spiercontractie fenotype van eiwit te karakteriseren O-mannosyltransferase mutanten. Gegevens verkregen uit deze opnames kunnen worden gebruikt om spiercontractie golven te analyseren, inclusief frequentie, richting van vermeerdering en relatieve amplitude van spiercontracties op verschillende lichaams segmenten. We hebben ook de lichaamshouding onderzocht en gebruik gemaakt van een fluorescerende marker die specifiek in spieren is uitgedrukt om de positie van de embryo-middenlijn nauwkeurig te bepalen. Een soortgelijke aanpak kan ook worden gebruikt om verschillende andere gedragingen tijdens de ontwikkeling te bestuderen, zoals het rollen van embryo’s en broedeieren.
Introduction
Peristaltische spiercontractie is een ritmisch motorische gedrag vergelijkbaar met wandelen en zwemmen bij mensen1,2,3. Embryonale spiercontracties gezien in Drosophila late stadium embryo’s vormen een voorbeeld van een dergelijk gedrag. Drosophila is een uitstekend modelorganisme om verschillende ontwikkelingsprocessen te bestuderen, omdat de embryonale ontwikkeling in Drosophila goed gekarakteriseerd, relatief kort en gemakkelijk te monitoren is. Het algemene doel van onze methode is om het wavelike patroon van contractie en ontspanning van embryonale spieren zorgvuldig op te nemen en te analyseren. We gebruikten een eenvoudige, niet-invasieve aanpak die een gedetailleerde visualisatie, opname en analyse van spiercontracties biedt. Deze methode kan ook worden gebruikt om andere in vivo processen te bestuderen, zoals embryonaal rollen gezien in laat stadium embryo’s net voor het uitkomen. In eerdere studies werden embryonale spiercontracties voornamelijk geanalyseerd in termen van frequentie en richting1,2. Om de relatieve omvang van de weeën te schatten als ze langs de hoofdas in de voorste of achterste richting gaan, hebben we embryo’s gebruikt om GFP specifiek in spieren uit te drukken. Deze analyse biedt een meer kwantitatieve manier om te analyseren spiercontracties en om te onthullen hoe de lichaamshouding in embryo’s wordt gehandhaafd tijdens de reeks van peristaltische golven van spiercontracties.
Peristaltische spiercontracties worden bestuurd door centrale patroon Generator (CPG) circuits en communicatie tussen neuronen van het perifere zenuwstelsel (PNS), het centrale zenuwstelsel (CNS), en de spieren4,5. Het niet produceren van normale peristaltische spiercontracties kan leiden tot defecten zoals het niet uitkomen van2 en abnormale larvale motoriek6 en kan indicatief zijn voor neurologische afwijkingen. Live beeldvorming van peristaltische golven van spiercontractie en gedetailleerde analyse van contractie fenotypes kunnen helpen bij het ontdekken van pathogene mechanismen in verband met genetische defecten die invloed hebben op de spieren en neurale circuits die betrokken zijn bij de motoriek. Onlangs gebruikten we die benadering om mechanismen te onderzoeken die resulteren in een lichaamshouding torsie fenotype van protein O–mannosyltransferase (pomt) mutanten7.
Proteïne O-mannosylation (POM) is een speciaal type posttranslationele modificatie, waarbij een mannose-suiker wordt toegevoegd aan serine-of Threonine-residuen van secretoire pathway-eiwitten8,9. Genetische defecten in POM veroorzaken aangeboren spier dystrofieën (CMD) bij de mens10,11,12. We onderzochten de causatieve mechanismen van deze ziekten met behulp van Drosophila als een modelsysteem. We constateerden dat embryo’s met mutaties in Drosophila proteïne O-mannosyltransferase -genen POMT1 en POMT2 (a.k.a. geroteerde buik (RT) en twisted (tw)) een verplaatsing (“rotatie”) van lichaams segmenten, wat resulteert in een abnormale lichaamshouding7. Belangwekkend, dit defect viel samen met de ontwikkelingsfase wanneer peristaltische spiercontracties worden prominent7.
Aangezien abnormale lichaamshouding bij POM Mutant embryo’s ontstaat wanneer spieren en epidermis al worden gevormd en peristaltische golven van gecoördineerde spiercontracties zijn begonnen, veronderstellen we dat abnormale lichaamshouding een gevolg kan zijn van abnormale spier samentrekkingen in plaats van een defect in spier of/en epidermis morfologie7. Cmd’s kunnen worden geassocieerd met abnormale spiercontracties en houdings defecten13, en dus kan de analyse van de houdings fenotype in Drosophila pomt mutanten de pathologische mechanismen van spier dystrofieën verheldeert . Om de relatie tussen de lichaamshouding fenotype van Drosophila pomt mutanten en mogelijke afwijkingen in peristaltische golven van spiercontracties te onderzoeken, hebben we besloten om spiercontracties in detail te analyseren met behulp van een live Imaging-benadering.
Onze analyse van peristaltische contractie golven in Drosophila embryo’s onthulde twee verschillende contractie modi, aangeduid als type 1 en type 2-golven. Type 1 golven zijn eenvoudige golven die van voorste naar posterieure of omgekeerd. Type 2 golven zijn bifasische golven die beginnen aan het voorste uiteinde, de helft in de achterste richting voortplanten, kortstondig stoppen, een temporele statische contractie vormen, en vervolgens, tijdens de tweede fase, worden geveegd door een peristaltische contractie die voortgaat naar voren vanaf het achterste uiteinde. Wild-type embryo’s genereren normaalgesproken een reeks contracties die bestaat uit ongeveer 75% type 1 en 25% type 2 golven. In tegenstelling, genereren Pomt Mutant embryo’s type 1 en type 2 golven op ongeveer gelijke relatieve frequenties.
Onze aanpak kan gedetailleerde informatie bieden voor kwantitatieve analyse van spiercontracties en embryo Rolling7. Deze aanpak kan ook worden aangepast voor analyses van andere gedragingen waarbij spiercontracties, zoals uitbroeden en kruipen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze methode biedt een kwantitatieve manier om belangrijk embryo gedrag tijdens de ontwikkeling te analyseren, zoals peristaltische spiercontractie golven, waaronder golf periodetijd, amplitude en patroon, evenals golfeffect op het rollen en de houding van het embryo. Dit kan nuttig zijn bij analyses van verschillende mutanten om de rol van specifieke genen bij het reguleren van deze en andere gedragingen tijdens de embryonale ontwikkeling te bestuderen. We hebben veranderingen in de spier-specifieke GFP-marker intensite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het project werd deels gesteund door National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534, en CONACYT 2012-037 (S) naar VP.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. 유전학. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B., Hames, B. D. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. , 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
