ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析
Summary
ここでは、ショウジョウバエ胚における胚筋収縮を非侵襲的かつ詳細指向的に記録する方法を提示する。
Abstract
協調筋収縮は、ショウジョウバエ胚の発達の初期に見られるリズミカルな行動の一形態である。この動作を制御するには、ニューロン感覚フィードバック回路が必要です。収縮のリズミカルなパターンを生成する失敗は、神経学的異常を示すことができます。我々は以前、タンパク質O-mannosylation(翻訳後タンパク質修飾)の欠陥が感覚ニューロンの軸質形態に影響を及ぼし、胚の異常な協調筋収縮をもたらすことを発見した。ここでは、タンパク質の筋肉収縮表現型を特徴付けるために使用した後期胚の生画像を用いて、蠕動脈性筋収縮のパターンを記録・解析する比較的簡単な方法を提示する。O-マンノシルトランスフェラーゼ変異体。これらの記録から得られたデータは、周波数、伝播の方向および異なる身体セグメントにおける筋肉収縮の相対振幅を含む筋肉収縮波を分析するために使用することができる。また、体の姿勢を調べ、筋肉に特異的に発現した蛍光マーカーを利用して、胚の中線の位置を正確に決定しました。同様のアプローチは、胚の転がりや孵化など、発達中の様々な他の行動を研究するためにも利用できます。
Introduction
蠕動筋収縮は、人間1、2、3の歩行および水泳に似たリズミカルな運動行動である。ショウジョウバエ後期胚に見られる胚筋収縮は、そのような行動の一例を表す。ショウジョウバエは、ショウジョウバエの胚発生が特徴的で、比較的短く、監視しやすいため、様々な発達過程を研究する優れたモデル生物です。私たちの方法の全体的な目標は、胚筋の収縮と弛緩の波のようなパターンを慎重に記録し、分析することです。私たちは、筋肉の収縮の詳細な視覚化、記録と分析を提供するシンプルで非侵襲的なアプローチを使用しました。この方法は、孵化直前の後期胚に見られる胚転がりなど、生体内の他のプロセスを研究するためにも使用できる可能性がある。以前の研究では、胚性筋収縮は主に頻度と方向1、2の観点から分析された。前方向または後方向に体軸に沿って進行する収縮の相対的な程度を推定するために、我々は筋肉に特にGFPを発現する胚を使用した。この分析は、筋肉の収縮を分析し、筋肉収縮の一連の蠕タルな波の間に胚の体の姿勢がどのように維持されるかを明らかにするより定量的な方法を提供します。
蠕動筋収縮は、中枢パターン発生器(CPG)回路および末梢神経系(PNS)、中枢神経系(CNS)、および筋肉4、5のニューロン間の通信によって制御される。正常な蠕動性筋収縮を生じさせることができないと、孵化2および異常な幼虫移動6の障害などの欠陥を引き起こし、神経学的異常を示す可能性がある。筋肉収縮の周座波のライブイメージングと収縮型の詳細な分析は、移動に関与する筋肉や神経回路に影響を与える遺伝的欠陥に関連する病原性メカニズムを明らかにするのに役立ちます。我々は最近、そのアプローチを用い、pロテインO-mアノシルtランスフェラーゼ(POMT)変異体7の体姿勢ねじり表現型をもたらすメカニズムを調査した。
タンパク質Oマンノシル化(POM)は、分泌経路タンパク質のセリンまたはスレオニン残基にマンノース糖を添加する特別なタイプの翻訳後修飾である8,9である。POMの遺伝的欠陥は、ヒト10、11、12における先天性筋ジストロフィー(CMD)を引き起こす。ショウジョウバエをモデルシステムとして用いて、これらの疾患の原因メカニズムを調べました。ショウジョウバエタンパク質O-mannosyltransferase遺伝子POMT1およびPOMT2(別名、回転腹部(rt)およびねじれ(tw)の変異を有する胚は、 体のセグメントの変位(「回転」)は、異常な体の姿勢7をもたらす。興味深いことに、この欠陥は、蠕因性筋収縮が顕著になると発達段階と一致した7.
筋肉と表皮が既に形成され、協調筋収縮の蠕動波が始まったときにPOM変異胚の異常な体姿勢が生じるので、異常な体の姿勢は異常な筋肉の結果である可能性があると仮定した。筋肉や表皮の形態の欠陥よりもむしろ収縮7.CMDは、異常な筋肉収縮および姿勢欠陥13に関連することができ、したがって、ショウジョウバエPOMT変異体における姿勢表現型の分析は、筋ジストロフィーに関連する病理学的メカニズムを解明しうる.ショウジョウバエPOMT変異体の体姿勢表現型と筋収縮の蠕動脈波の異常との関係を調べるため、生を用いて筋肉収縮を詳細に解析することにした。イメージングアプローチ。
ショウジョウバエ胚の蠕因性収縮波の分析により、タイプ1とタイプ2の波に指定された2つの異なる収縮モードが明らかになった。タイプ1波は、前から後部に伝播する単純な波、またはその逆です。タイプ2波は、前端で開始し、後方の途中で伝播し、一時的に停止し、時間的静的収縮を形成し、第2段階の間に、伝播する蠕動収縮によって掃引される二相波である。後端から前方に進む。野生型胚は通常、約75%タイプ1と25%タイプ2波から成る一連の収縮を生成する。対照的に、POMT変異型胚は、ほぼ等しい相対周波数でタイプ1とタイプ2波を生成します。
我々のアプローチは、筋肉収縮および胚転がり7の定量分析のための詳細な情報を提供することができる。このアプローチは、ハッチングやクロールなどの筋肉の収縮を伴う他の行動の分析にも適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、波周期、振幅、パターン、胚の転がりや姿勢に対する波の影響など、発達中の重要な胚の行動を定量的に解析する方法です。これは、胚発生時にこれらおよび他の行動を調節する際の特定の遺伝子の役割を研究するために、異なる変異体の分析に有用でありうる。我々は、筋肉特異的GFPマーカー強度の変化を使用して、胚における筋肉収縮振幅、周波数および収縮波伝播の方向?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、国立衛生補助金RO1 NS099409、NS075534、CONACYT 2012-037(S)のVPによって一部支援されました。
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. 유전학. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B., Hames, B. D. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. , 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
