Imagen en vivo y análisis de contracciones musculares en Drosophila Embryo
Summary
Aquí, presentamos un método para registrar contracciones musculares embrionarias en embriones de Drosophila de una manera no invasiva y orientada a los detalles.
Abstract
Las contracciones musculares coordinadas son una forma de comportamiento rítmico que se ve temprano durante el desarrollo en embriones de Drosophila. Se requieren circuitos neuronales de retroalimentación sensorial para controlar este comportamiento. No producir el patrón rítmico de las contracciones puede ser indicativo de anomalías neurológicas. Anteriormente encontramos que los defectos en la proteína O-mannosilación, una modificación de la proteína posttranslacional, afectan la morfología del axón de las neuronas sensoriales y dan lugar a contracciones musculares coordinadas anormales en embriones. Aquí, presentamos un método relativamente simple para registrar y analizar el patrón de contracciones musculares peristálticas mediante imágenes en vivo de embriones en etapa tardía hasta el punto de eclosión, que utilizamos para caracterizar el fenotipo de contracción muscular de la proteína Mutantes o-mannosyltransferasa. Los datos obtenidos de estas grabaciones se pueden utilizar para analizar las ondas de contracción muscular, incluyendo la frecuencia, dirección de propagación y amplitud relativa de las contracciones musculares en diferentes segmentos del cuerpo. También hemos examinado la postura corporal y aprovechado un marcador fluorescente expresado específicamente en los músculos para determinar con precisión la posición de la línea media del embrión. Un enfoque similar también se puede utilizar para estudiar varios otros comportamientos durante el desarrollo, como laminación de embriones y la eclosión.
Introduction
La contracción muscular peristáltica es un comportamiento motor rítmico similar a caminar y nadar en humanos1,2,3. Las contracciones musculares embrionarias que se ven en los embriones de etapa tardía de Drosophila representan un ejemplo de tal comportamiento. La drosofilia es un excelente organismo modelo para estudiar varios procesos de desarrollo porque el desarrollo embrionario en Drosophila está bien caracterizado, relativamente corto y fácil de monitorear. El objetivo general de nuestro método es registrar y analizar cuidadosamente el patrón ondulación de contracción y relajación de los músculos embrionarios. Utilizamos un enfoque simple y no invasivo que ofrece una visualización detallada, registro y análisis de las contracciones musculares. Este método también se puede utilizar potencialmente para estudiar otros procesos in vivo, como la rodadura embrionaria que se ve en embriones de etapa tardía justo antes de la eclosión. En estudios anteriores, las contracciones musculares embrionariasse analizaron principalmente en términos de frecuencia y dirección 1,2. Con el fin de estimar el alcance relativo de las contracciones a medida que avanzan a lo largo del eje del cuerpo en la dirección anterior o posterior, hemos utilizado embriones que expresan GFP específicamente en los músculos. Este análisis proporciona una forma más cuantitativa de analizar las contracciones musculares y revelar cómo se mantiene la postura corporal en embriones durante una serie de ondas peristálticas de contracciones musculares.
Las contracciones musculares peristálticas son controladas por circuitos de generador de patrones centrales (CPG) y comunicaciones entre las neuronas del sistema nervioso periférico (PNS), el sistema nervioso central (SNC) y los músculos4,5. No producir contracciones musculares peristálticas normales puede conducir a defectos tales como falla en la eclosión2 y locomoción larval anormal6 y puede ser indicativo de anomalías neurológicas. Las imágenes en vivo de ondas peristálticas de contracción muscular y análisis detallados de fenotipos de contracción pueden ayudar a descubrir mecanismos patógenos asociados con defectos genéticos que afectan a los músculos y circuitos neuronales involucrados en la locomoción. Recientemente usamos ese enfoque para investigar mecanismos que resultan en un fenotipo de torsión de postura corporal de protein O–mannosyltransferase (POMT) mutantes7.
La proteína O-mannosilación (POM) es un tipo especial de modificación posttranslacional, donde se añade un azúcar de manona a los residuos de serina o trionina de las proteínas secretas de la vía8,9. Los defectos genéticos en el POM causan distrofias musculares congénitas (CMD) en humanos10,11,12. Investigamos los mecanismos causales de estas enfermedades utilizando Drosophila como sistema modelo. Encontramos que los embriones con mutaciones en los genes de la proteína Drosophila O-mannosiltransferasa POMT1 y POMT2 (también k.a. abdomen rotado (rt) y retorcidos (tw)) muestran un desplazamiento (“rotación”) de los segmentos corporales, lo que resulta en una postura corporal anormal7. Curiosamente, este defecto coincidió con la etapa de desarrollo cuando las contracciones musculares peristálticas se vuelven prominentes7.
Dado que la postura corporal anormal en embriones mutantes POM surge cuando la musculatura y la epidermis ya están formadas y las ondas peristálticas de contracciones musculares coordinadas han comenzado, hipotetizado que la postura corporal anormal podría ser el resultado de un músculo anormal contracciones en lugar de un defecto en el músculo o /y epidermis morfología7. Las CMD pueden estar asociadas con contracciones musculares anormales y defectos de postura13,y por lo tanto el análisis del fenotipo de postura en mutantes Drosophila POMT puede aclarar los mecanismos patológicos asociados con distrofias musculares . Con el fin de investigar la relación entre el fenotipo de la postura corporal de los mutantes Drosophila POMT y las posibles anomalías en las ondas peristálticas de las contracciones musculares, decidimos analizar las contracciones musculares en detalle utilizando un enfoque de imágenes.
Nuestro análisis de ondas de contracción peristáltica en embriones droofílicos reveló dos modos de contracción distintos, designados como ondas de tipo 1 y tipo 2. Las ondas de tipo 1 son ondas simples que se propagan de anterior a posterior o viceversa. Las ondas de tipo 2 son ondas bifásicas que se inician en el extremo anterior, se propagan a mitad de camino en la dirección posterior, se detienen momentáneamente, forman una contracción estática temporal, y luego, durante la segunda fase, son barridas por una contracción peristáltica que se propaga hacia adelante desde el extremo posterior. Los embriones de tipo salvaje normalmente generan una serie de contracciones que consiste en aproximadamente 75% tipo 1 y 25% ondas tipo 2. Por el contrario, los embriones mutantes POMT generan ondas de tipo 1 y tipo 2 a frecuencias relativas aproximadamente iguales.
Nuestro enfoque puede proporcionar información detallada para el análisis cuantitativo de las contracciones musculares y la rodadura de embriones7. Este enfoque también podría adaptarse para analizar otros comportamientos relacionados con las contracciones musculares, como el eclosión y el rastreo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro método proporciona una manera cuantitativa de analizar comportamientos importantes de embriones durante el desarrollo, como ondas de contracción muscular peristáltica, incluyendo periodicidad de onda, amplitud y patrón, así como el efecto de onda sobre la rotación y la postura de embriones. Esto puede ser útil en análisis de diferentes mutantes para estudiar el papel de genes específicos en la regulación de estos y otros comportamientos durante el desarrollo embrionario. Hemos utilizado cambios en la in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud RO1 NS099409, NS075534 y CONACYT 2012-037(S) para vicepresidente.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. 유전학. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B., Hames, B. D. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. , 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
