Imagens ao vivo e análise de contrações musculares no embrião de Drosophila
Summary
Aqui, nós apresentamos um método para registrar contrações embrionárias do músculo em embriões da Drosophila em uma maneira não invasora e detalhe-orientada.
Abstract
As contrações musculares coordenadas são uma forma de comportamento rítmico observado precocemente durante o desenvolvimento em embriões de Drosophila . Os circuitos de feedback sensorial neuronal são necessários para controlar esse comportamento. A falha produzir o teste padrão rítmico das contrações pode ser indicativa de anomalias neurológicas. Nós encontramos previamente que os defeitos na proteína O-mannosylation, uma modificação posttranslational da proteína, afetam a morfologia do axônio de neurônios sensoriais e resultam em contrações coordenadas anormais do músculo nos embriões. Aqui, nós apresentamos um método relativamente simples para gravar e analisar o teste padrão de contrações peristáltica do músculo pela imagem latente viva de embriões do estágio atrasado até o ponto da eclosão, que nós usamos para caracterizar o phenotype da contração do músculo da proteína Mutants O-mannosyltransferase. Os dados obtidos a partir dessas gravações podem ser utilizados para analisar as ondas de contração muscular, incluindo frequência, direção de propagação e amplitude relativa de contrações musculares em diferentes segmentos corporais. Nós igualmente examinamos a postura do corpo e tomado a vantagem de um marcador fluorescente expressado especificamente nos músculos para determinar exatamente a posição do midline do embrião. Uma aproximação similar pode igualmente ser utilizada para estudar vários outros comportamentos durante o desenvolvimento, tal como o rolamento e a eclosão do embrião.
Introduction
A contração do músculo peristáltico é um comportamento motor rítmico semelhante ao andar e nadar em humanos1,2,3. As contrações musculares embrionárias observadas em embriões de fase tardia da Drosophila representam um exemplo de tal comportamento. A Drosophila é um organismo modelo excelente para estudar vários processos de desenvolvimento, porque a evolução embrionária na Drosophila é bem caracterizada, relativamente curta e fácil de monitorizar. O objetivo geral do nosso método é registrar e analisar cuidadosamente o padrão wavelike de contração e relaxamento dos músculos embrionários. Utilizamos uma abordagem simples, não invasiva, que oferece uma visualização detalhada, gravação e análise de contrações musculares. Este método também pode ser potencialmente utilizado para estudar outros processos in vivo, tais como o rolamento embrionário visto em embriões de estágio tardio, pouco antes da eclosão. Em estudos prévios, as contrações musculares embrionárias foram analisadas principalmente em termos de frequência e direção1,2. A fim de estimar a extensão relativa das contrações à medida que progridem ao longo do eixo do corpo na direção anterior ou posterior, usamos embriões expressando GFP especificamente nos músculos. Esta análise fornece uma forma mais quantitativa de analisar as contrações musculares e revelar como a postura corporal em embriões é mantida durante a série de ondas peristálticas de contrações musculares.
Contrações musculares peristálticas são controladas por circuitos de gerador de padrão central (CPG) e comunicações entre os neurônios do sistema nervoso periférico (PNS), o sistema nervoso central (SNC) e os músculos4,5. A falha produzir contrações peristáltica normais do músculo pode conduzir aos defeitos tais como a falha ao chocar2 e a locomoção larval anormal6 e pode ser indicativa de anomalias neurológicas. A imagem latente viva de ondas peristáltica da contração do músculo e a análise detalhada de fenótipos da contração podem ajudar a descobrir os mecanismos patogénicos associados com os defeitos genéticos que afetam os músculos e os circuitos neural envolvidos na locomoção. Nós usamos recentemente essa aproximação para investigar os mecanismos que resultam em um phenotype da torção da postura do corpo de mutantes de protein O–mannosyltransferase (pomt)7.
A proteína O-mannosilação (POM) é um tipo especial de modificação pós-translacional, onde um açúcar de manose é adicionado aos resíduos de serina ou treonina de proteínas da via secretora8,9. Defeitos genéticos em POM causam distrofias musculares congênitas (CMD) em humanos10,11,12. Nós investigamos os mecanismos causais destas doenças usando a Drosophila como um sistema modelo. Nós encontramos que os embriões com mutações nos genes POMT1 e POMT2 da proteína O-mannosyltransferase de Drosophila (aka girado abdômen (RT) e Twisted (TW)) mostram um deslocamento (“rotação”) dos segmentos corporais, o que resulta em uma postura corporal anormal7. Curiosamente, este defeito coincidiu com o estágio de desenvolvimento quando as contrações musculares peristálticas se tornam proeminentes7.
Desde que a postura anormal do corpo em embriões do mutante de POM levanta-se quando a musculatura e a epiderme são formadas já e as ondas peristáltica de contrações coordenadas do músculo começaram, nós supor que a postura anormal do corpo poderia ser um resultado do músculo anormal contrações em vez de um defeito no músculo ou/e na morfologia da epiderme7. CMDs pode ser associado com as contrações musculares anormais e defeitos da postura13, e assim a análise do phenotype da postura em mutantes de Drosophila pomt pode elucidar os mecanismos patológicos associados com as distrofias musculares . A fim investigar a relação entre o phenotype da postura do corpo de mutantes de Drosophila pomt e de anomalias possíveis em ondas peristáltica de contrações do músculo, nós decidimos analisar as contrações do músculo em detalhe usando um vivo abordagem de imagem.
Nossa análise de ondas de contração peristáltica em embriões de Drosophila revelou dois modos distintos de contração, designados como ondas tipo 1 e tipo 2. As ondas do tipo 1 são ondas simples propagando-se de anterior para posterior ou vice-versa. As ondas tipo 2 são ondas bifásicas que iniciam na extremidade anterior, propagam-se a meio caminho na direção posterior, momentaneamente interrompem, formando uma contração estática temporal, e então, durante a segunda fase, são varridos por uma contração peristáltica que se propaga para a frente da extremidade posterior. Embriões de tipo selvagem normalmente geram uma série de contrações que consiste em aproximadamente 75% tipo 1 e 25% tipo 2 ondas. Em contraste, os embriões Pomt Mutant geram ondas tipo 1 e tipo 2 em frequências relativas aproximadamente iguais.
Nossa abordagem pode fornecer informações detalhadas para análise quantitativa das contrações musculares e do embrião circulante7. Essa abordagem também pode ser adaptada para análises de outros comportamentos envolvendo contrações musculares, como eclosão e rastejamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso método fornece uma maneira quantitativa de analisar comportamentos importantes do embrião durante o desenvolvimento, tais como ondas peristáltica da contração do músculo, incluindo a periodicidade da onda, a amplitude e o teste padrão, assim como o efeito da onda no rolamento e na postura do embrião. Isso pode ser útil em análises de diferentes mutantes para estudar o papel de genes específicos na regulação desses e outros comportamentos durante o desenvolvimento embrionário. Foram utilizadas alteraç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O projeto foi apoiado em parte pelos institutos nacionais de subsídios à saúde RO1 NS099409, NS075534, e CONACYT 2012-037 (S) para VP.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
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