Summary
Os organóides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) oferecem oportunidades emocionantes para modelar doenças entéricas in vitro. Nós demonstramos a diferenciação de hiPSCs em organoids intestinais (iHOs), na estimulação destes iHOs com cytokines, e na microinjeção de Salmonella typhimurium no lúmen de Iho, permitindo o estudo de uma invasão epithelial por este Patógeno.
Abstract
O sistema intestinal ' organóide ' (iHO), em que as estruturas 3-D representativas do revestimento epitelial do intestino humano podem ser produzidas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) e mantidas em cultura, proporcionam uma oportunidade empolgante para facilitar a modelagem da resposta epitelial às infecções entéricas. In vivo, as células epiteliais intestinais (IECs) desempenham um papel fundamental na regulação da homeostase intestinal e podem inibir diretamente os patógenos, embora os mecanismos pelos quais isso ocorra não sejam totalmente elucidados. A citocinas interleucina-22 (IL-22) tem demonstrado desempenhar um papel na manutenção e defesa da barreira epitelial do intestino, incluindo a indução de uma liberação de peptídeos antimicrobianos e quimiocinas em resposta à infecção.
Nós descrevemos a diferenciação de hipscs saudáveis do controle em Ihos através da adição de combinações específicas do citocinas a seu meio de cultura antes de incorporá-las em um sistema prointestinal Matrix-based da cultura da membrana do porão. Uma vez incorporados, os iHOs são cultivados em meios suplementados com Noggin, R-spondin-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), CHIR99021, prostaglandina E2 e Y-27632 de dicloridrato mono-hidratado. As passagens semanais pelo rompimento manual do ultraestrutura do Iho conduzem à formação de Ihos broded, com o algum que exibe uma estrutura da cripta/villus. Todos os iHOs demonstram um epitélio diferenciado constituído por células de cálice, células enteroendócrinas, células Paneth e enterócitos polarizados, que podem ser confirmados através de imunocoloração para marcadores específicos de cada subconjunto celular, microscopia eletrônica de transmissão (TEM), e PCR quantitativo (qPCR). Para modelar a infecção, Salmonella enterica sorovar typhimurium SL1344 são microinjetados no lúmen dos Ihos e incubadas por 90 min a 37 ° c, e um ensaio de proteção de gentamicina modificada é realizado para identificar os níveis de invasão bacteriana. Alguns iHOs também são pré-tratados com IL-22 humano recombinante (rhIL-22) antes da infecção para determinar se esta citocinas é protetora contra a infecção por Salmonella .
Introduction
Nos últimos anos, o estudo das interações hospedeiro-patógenos tem sido aprimorado pelo desenvolvimento de modelos "organóides", em que as representações 3-D do epitélio intestinal podem ser produzidas a partir de vários progenitores. Os organóides ' primários ' podem ser gerados diretamente de células-tronco intestinais colhidas de biópsias intestinais. Além disso, os organóides intestinais podem ser gerados a partir de hiPSCs. O mesmo pode ser dito de numerosos tecidos, com1gástrico, fígado2, pancreáticos3,4, cérebro5,6, pulmão7, e próstata8 organóides usados por muitos pesquisadores para modelar Doença. Existem inúmeras aplicações emocionantes do sistema organóide, incluindo o câncer de modelagem9 e a triagem de drogas10, mas aqui nos concentramos no uso de Ihos como um modelo de infecção, usando S. enterica sorovar typhimurium (S. Typhimurium) como um micróbio patogénico e um pré-tratamento exemplares com IL-22 como uma terapia.
Neste estudo, os hiPSCs utilizados para gerar iHO são iPSCs ' Kolf2 ', gerados a partir de um indivíduo saudável e disponível a partir do consórcio de iniciativa de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (HipSci; www.hipsci.org), um painel de referência de acesso aberto de caracterizado linhas hiPSC11. Uma vantagem de usar hiPSCs como progenitores para organoids é que há agora os bancos extensivos de linhas iPSC fornecedoras saudáveis disponíveis, significando que os resultados podem ser validados em um número de linhas de pilha com origens genéticas diferentes. Além disso, se os pesquisadores desejarem examinar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) específicos associados à doença, é possível usar CRISPR/Cas9 para projetar mutações em uma linha celular saudável, produzindo assim uma linha mutante e mantendo o isogênico linha de controle para comparação12. Em nossa experiência, os organóides intestinais derivados do hiPSC são maiores em tamanho do que seus homólogos primários e mais consistentes na cultura, fazendo uma microinjeção menos tecnicamente desafiadora e potencialmente permitindo que uma gama mais diversificada de patógenos seja Estudou. os iHOs podem ser preservados criogenicamente, e nós propagamos culturas iHO por até um ano para produzir material para experimentação.
In vivo, os IECs desempenham um papel fundamental na regulação da homeostase intestinal e podem inibir diretamente os patógenos, embora os mecanismos pelos quais isso ocorra não sejam bem compreendidos. A citocina IL-22 é conhecida por ter um papel na manutenção da barreira epitelial do intestino13 e está envolvida na indução e secreção de peptídeos antimicrobianos e quimiocinas em resposta à infecção14. É produzida por células T ativadas (particularmente, células Th17), bem como por células naturais do assassino (NK) e se liga a um receptor heterodimérica composto por subunidades15de Il-22r1 e Il-10r2. O receptor para IL-22 é expressado basally em IECs, significando aquele no modelo de iHO, é possível pretreat os organoids com rhIL-22 simplesmente por sua adição ao meio de cultura16. Uma desvantagem do sistema organóide é que carece da resposta imune associada normalmente entregue por outros tipos de células imunológicas; no entanto, estão surgindo modelos que tentam cocultura organóides com linfócitos intestinais para melhor representá-los17,18.
O uso do sistema de microinjeção é fundamental para simular infecções no modelo iHO, uma vez que isso permite a entrega direta de patógenos à superfície apical do epitélio, como ocorreria no caso de infecção in vivo. A adição de vermelho de fenol à solução bacteriana injetada no iHO marca os que foram infectados, evitando assim injeções repetidas da mesma iHO. Os organóides como vasos para modelagem de infecção estão crescendo em uso, com patógenos como Helicobacter pylori,19 o norovirus,20 o rotavírus,21 Escherichia coliprodutoras de toxina Shiga22, Cryptosporidium23, e o vírus Zika24 tendo sido demonstrado para sobreviver e replicar dentro desses sistemas. Esta tecnologia poderia ser aplicada a uma escala mais larga dos micróbios patogénicos, particular aos organismos que são difíceis à cultura, tais como Protozoa, ou os micróbios patogénicos restritos humanos, a fim obter a informação direta sobre a resposta epithelial humana à infecção.
Protocol
1. cultivo e Passaging de células-tronco pluripotentes induzidas
Nota: Todos os métodos descritos aqui usam linhas de células humanas comercialmente disponíveis. Todo o trabalho da cultura do tecido detalhado abaixo deve ser feito em uma capa laminar do fluxo da classe II. os iPSCs são mantidos rotineiramente no meio de cultura da pilha de haste (veja a tabela dos materiais), como por as instruções do fabricante, que permite uma cultura Weekend-Free de iPSCs. iPSCs pode ser adaptado de outros sistemas de cultura iPSC com relativa facilidade.
- Passe as células uma vez que as colônias cobrem aproximadamente 80% – 90% da superfície da placa.
- Prepare as placas para a passagem 1 h antes do uso adicionando a vitronectina 10 μg/mL diluída na solução salina tampão fosfato de Dulbecco (DPBS; sem cálcio [ca] ou magnésio [MG]) para placas tratadas com cultura de tecido. Os volumes para revestimento dependem do tamanho da placa e podem ser encontrados nas instruções do fabricante. Durante este tempo, aqueça o meio de cultura da pilha de haste à temperatura ambiente (RT).
- Retire a mídia do iPSCs pronto para a passagem e lave as células 2x com DPBS (sem CA ou mg).
- Adicionar solução de EDTA (veja a tabela de materiais) para as placas, certificando-se de toda a superfície é revestida e INCUBAR em RT para 5 – 8 min. Quando os furos começam a aparecer no centro das colônias de iPSC, aspirar e descartar a solução de EDTA.
- Adicionar meio de cultura de células-tronco aos poços; desalojar os iPSCs delicadamente lavando meios sobre a superfície da placa algumas vezes. Os iPSCs são passados como aglomerados e não como únicas pilhas, assim que certifique-se de que a solução do EDTA não é deixada sobre por demasiado por muito tempo. Mova todos os iPSCs desalojados para um tubo cônico de 15 mL.
- Aspirar a vitronectina das placas pré-revestidas e substituí-la por meio de cultura de células estaminais. Inverta a suspensão de iPSC um número de vezes para certificar-se que os iPSCs não se estabeleceram na parte inferior do tubo cónico, e adicionam o volume apropriado de suspensão para dar uma diluição 1:10 das pilhas em uma placa nova. As proporções divididas podem ser ajustadas dependendo da taxa de crescimento do iPSC, que pode variar entre as linhas iPSC.
- Balanç a placa para dispersar os iPSCs sobre a superfície e coloc o em uma incubadora em 37 ° c/5% CO2. Alimente os iPSCs no dia após o passaging.
2. diferenciação de iPSCs para o hindgut
- No dia 0, divida o iPSCs em um prato tecido-cultura-Tratado de 10 cm, pré-revestido com o vitronectina como descrito na etapa 1,2, em 10 ml do meio de cultura da pilha de haste suplementado com o activina a (10 ng/ml) + o fator de crescimento básico do fibroblasto (bFGF; 12 ng/ml). Adicione os fatores de crescimento para a mídia diretamente antes de usar; fazer isso em todas as etapas subsequentes.
- No dia 1, mude a mídia (10 ml de meio de cultura de células-tronco com activina a [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]).
- No dia 2, comece a diferenciação mudando a mídia para 10 ml de meio de cultura de células-tronco suplementado com os seguintes fatores de crescimento: activina a (100 ng/ml), bfgf (100 ng/ml), Proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4; 10 ng/ml), fosfoinositol 3- inibidor da quinase LY294002 (10 μM) e inibidor GSK3 CHIR99021 (3 μM).
- No dia 3, mude a mídia para 10 ml de meio de cultura de células-tronco suplementado com activina a (100 ng/ml), bfgf (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml) e LY294002 (10 μm). A especificação endoderm induzida por esta mídia deve resultar em alterações visíveis na morfologia das colônias de iPSC ao longo dos próximos 24 h.
- No dia 4, mude a mídia para 10 ml de mídia RPMI/B27 suplementada com activina a (100 ng/ml) e bfgf (100 ng/ml).
Nota: Os meios de comunicação RPMI/B27 contêm 500 mL de meio RPMI com suplemento de L-glutamina (ver tabela 1), 10 ml de suplemento B27 (50x, soro livre) e 5 ml de aminoácidos não essenciais. Opcional: Adicionar 5 mL de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL). Filtre-esterilize antes de usar. - No dia 5, mude a mídia para 10 ml de mídia RPMI/B-27 suplementada com activina a (50 ng/ml).
- No dia 6, para iniciar a padronização do endoderma posterior ao retrointestino, alterar a mídia para 10 ml de RPMI/B27 Media suplementado com CHIR99021 (6 μm) + retinóico (3 μm).
- Nos dias 7, 8e 9, repita a etapa 2,7. Durante estas etapas, as estruturas 3-D visíveis do intestino traseiro devem tornar-se aparentes, cobrindo a superfície da placa.
- No dia 10, incorpore o hindgut resultante na matriz da membrana do porão (veja a tabela dos materiais).
3. incorporação do hindgut na matriz da membrana do porão
- Compõem a mídia de crescimento da base iHO (500 mL do meio de Eagle modificado de Dulbecco avançado [DMEM]/F12, 10 mL de suplemento B27 [50x, soro livre], 5 mL de suplemento N2 [100x, soro livre], 5 mL de ácido 1 M 4-(2-hidroxietil) -1-piperazineetanossulfónico (HEPES), e 5 mL de aminoácidos não essenciais [100x]. Opcional: Adicionar 5 mL de penicilina-estreptomicina [10.000 U/mL]; filtro-esterilize antes de usar. Ver tabela 1).
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Retire a mídia da placa do retrointestino e lave a placa 1x com DPBS (sem CA ou mg). Adicionar 5 mL de solução de colagenase à placa e incubar a 37 ° c durante 5 min.
- Produza a solução de colagenase adicionando 500 mg de pó de colagenase IV a 400 ml de DMEM/F12 avançado. Após isso, adicione 100 mL de reposição sérica (ver tabela de materiais), 5 ml de L-glutamina (200 mm) e 3,5 μL de 2-Mercaptoetanol, e agite a solução para misturar. Filtre-esterilize a solução quando o pó de colagenase estiver totalmente dissolvido.
Nota: Isso pode ser armazenado a-20 ° c por até 6 meses em alíquotas menores.
- Produza a solução de colagenase adicionando 500 mg de pó de colagenase IV a 400 ml de DMEM/F12 avançado. Após isso, adicione 100 mL de reposição sérica (ver tabela de materiais), 5 ml de L-glutamina (200 mm) e 3,5 μL de 2-Mercaptoetanol, e agite a solução para misturar. Filtre-esterilize a solução quando o pó de colagenase estiver totalmente dissolvido.
- Inative a colagenase adicionando 5 mL de mídia de crescimento base iHO à placa e raspar as células do intestino traseiro usando um raspador de células, coletando a suspensão do intestino traseiro em um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugue a 240 x g durante 1 min e pipetando o sobrenadante.
- Adicionar 10 mL de mídia, dividir o hindgut em pedaços menores por pipetagem suavemente, e centrifugar novamente a 95 x g por 1 min.
- Lave as células 2x na mídia de crescimento base iHO, repetindo a etapa 3,5. Resuspender as células em um pequeno volume de meio de crescimento base (~ 300 – 500 μL) e acrescentar cerca de 100 μL desta solução a 1,5 mL de matriz de membrana basal. A matriz deve permanecer no gelo durante este tempo, pois começará a solidificar rapidamente na RT.
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Configurar uma chapa de 24 poços num aquecedor de placas a 37 ° c e identificar 60 μL num poço da chapa de 24 poços. Deixe-o definir brevemente e verifique a densidade um microscópio.
- Se necessário, adicione mais a solução do hindgut à matriz da membrana do porão nos incrementos até que a concentração desejada esteja conseguida, e manche para fora a solução nos poços restantes.
- Incubar a 37 ° c durante 10 min; em seguida, acrescentar 800 μL de meios de crescimento base iHO que contenham factores de crescimento para cada poço da placa de 24 poços nas seguintes concentrações (ver tabela 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml factor de crescimento epidérmico (FEG), 3 μm CHIR99021, 2,5 μm prostaglandina E2 e 10 μM Y-27632 de dicloridrato mono-hidratado (inibidor da rocha).
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Mude a mídia de crescimento base iHO a cada 2 – 3 dias, ou imediatamente se a mídia começa a descolorir. Após a semeadura inicial na matriz da membrana do porão, permita que os iHOs desenvolvam-se por 7 dias antes de rachá-los. Por dia 3 – 4, esferas distintas devem ser visíveis na cultura.
- Para a alteração de mídia por si só, omitir Y-27632, como isso só é necessário ao dividir/semear.
4. manutenção e passagem de iHOs
- Para permitir a descongelamento gradual, colocar para fora o volume necessário de matriz de membrana do porão em um balde de gelo coberto a 4 ° c durante a noite, 24 h antes da divisão.
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Retire a mídia dos iHOs e substitua-a por 500 μL de solução de levantamento celular (consulte a tabela de materiais) por poço. Incubar a 4 ° c durante 40 – 50 min, altura em que os iHOs devem flutuar na solução.
- Opcional: Use um sistema de imagem em capa para selecionar apenas iHOs com a morfologia desejada (consulte a tabela de materiais).
- Pipetando suavemente a suspensão da solução de elevação iHO/Cell em tubos cônicos de 15 mL, tentando não separar os iHOs. Permita que os IHOs se acomode por 3 – 5 min e removam o sobrenadante e as células únicas.
- Resuspend os Ihos em 5 ml de Iho médio crescimento base e pipeta-los suavemente para lavar. Centrifugue a 95 x g durante 2 min.
- Configurar uma chapa de 24 poços num aquecedor de placas a 37 ° c dentro do exaustor.
- Retire o sobrenadante e ressuspender os iHOs em ~ 300 – 500 μL de meios de crescimento base, usando uma pipeta P1000 para separar os iHOs em pedaços menores. Observe que a força que precisa ser aplicada variará dependendo da linha iHO e do estado de maturação, então comece suavemente, aumentando a força, se necessário.
- Coloc ~ 100 μL dos iHOs (o volume é dependente da densidade da solução) em 1,5 mL da matriz da membrana do porão e da pipeta momentaneamente para misturar.
- Spot para fora 1 x 60 μL da matriz da membrana do porão em um poço da placa de 24 poços, deixe-o para solidificar para ~ 30 s, e verific então a densidade o microscópio. Se a densidade for muito baixa, adicione mais iHOs à matriz.
- Repita a etapa 4,8 até que a densidade correta seja adquirida e, em seguida, identificar o resto da matriz em uma placa de 24 poços.
- Coloque-o em uma incubadora a 37 ° c por 10 min e, em seguida, sobreponha-o com 800 μL de meio de crescimento base com fatores de crescimento, conforme descrito na etapa 3,7.
-
Para preparar os iHOs para um experimento de ensaio de invasão (descrito abaixo), passe os iHOs 4 – 5 dias antes do experimento, conforme descrito nas etapas 4.1 – 4.10, mas coloque 120 μL da solução iHO da matriz gerada na etapa 4,7 em pratos de microinjeção de fundo de vidro de 5 mm.
- Ao invés de deixar a suspensão iHO em uma gota como com rotina de passaging, espalhe a gota sobre a parte inferior do prato para criar uma fina camada de matriz. Cubra-o com 2,5 mL de meio de crescimento base mais fatores de crescimento.
Nota: Se os antibióticos tiverem sido utilizados em meio de cultura, estes devem ser removidos e substituídos por meios suplementados não antibióticos para experimentos de microinjeção.
- Ao invés de deixar a suspensão iHO em uma gota como com rotina de passaging, espalhe a gota sobre a parte inferior do prato para criar uma fina camada de matriz. Cubra-o com 2,5 mL de meio de crescimento base mais fatores de crescimento.
5. prestimulação de iHOs com rhIL-22
- Aspirar a mídia dos iHOs e substituí-lo com a mídia de crescimento base fresca (que não deve conter antibióticos) 18 h antes do ensaio de invasão.
- Adicione o rhIL-22 aos meios de cultura a uma concentração final de 100 ng/mL.
6. microinjeção de iHOs e ensaios de invasão intracelular
- No dia anterior ao experimento, configure S. Typhimurium SL1344 cultura em 10 mL de caldo Luria-Bertani e incubar a 37 ° c durante a noite com agitação.
- No dia do experimento, se um microscópio com uma câmara de calor fechada estiver disponível, ligue-o e permita que a temperatura atinja 37 ° c antes de iniciar o ensaio.
- Diluir culturas bacterianas durante a noite em DPBS (contendo CA e mg) a uma densidade óptica de 2 a 600 nm (OD600) e, em seguida, misture 1:1 com vermelho fenol.
- Coloque o prato de microinjeção contendo iHOs no estágio do microscópio, retire a tampa e coloque os iHOs em foco, prontos para começar a injeção.
- Gire o injector e as estações de controle do braço sobre. Assegure-se de que o injector esteja ajustado a uma pressão de 600 kPa e a um tempo da injeção de 0,5 s. Se ainda não estiver afastado da fase do microscópio, rode o braço de injecção para se certificar de que está.
- Configure uma ponta de broca de microinjeção de 6 μm removendo a embalagem e o cilindro de plástico da agulha. Retire a cabeça de aperto do braço injectável.
- Carregue a ponta da broca com 10 μL do inóculo, segurando suavemente a ponta da broca na extremidade sem corte. Coloque a ponta da broca na cabeça da pega e volte a anexá-la ao braço de microinjeção.
-
Mova suavemente o braço para a posição de modo a que a agulha se situe 1 – 2 cm acima do prato de microinjecção. Use o controle do braço para posicionar a ponta da agulha no centro do prato e abaixe-a até que esteja apenas sobre a superfície dos meios.
- Programe a estação de controle do braço para retornar a agulha a este ponto após todas as injeções.
- Concentre o microscópio nos iHOs e selecione o alvo para injetar. Posicione a agulha logo acima e à direita do iHO a ser injetado e mova a agulha para baixo e lateralmente para o lúmen iHO.
- Pressione o botão injetar no microinjector; a mistura bacteriana fenol-manchada emergirá da agulha. Injete cada iHO 3x. Injete pelo menos 30 iHOs por condição.
Nota: Devido à heterogeneidade no tamanho e estrutura do iHO dentro de uma cultura, é necessário injetar um grande número de iHOs para controlar a variação. - Quando todos os iHOs necessários forem injetados, retire a placa de microinjeção do estágio, substitua a tampa e incubar a placa a 37 ° c durante 90 min.
- Após 90 min, aspirar a mídia de crescimento e substituí-lo com 3 mL de solução de elevação celular; Incubar a 4 ° c durante 45 min.
- Mova suavemente a solução de elevação dos iHOs/células para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de DPBS. Certifique-se de que todos os iHOs injetados foram removidos da placa (lave a placa com 1 mL do DPBS, se necessário). Centrifugue a 370 x g durante 3 min.
- Retire o sobrenadante e ressuspender os iHOs em meios de crescimento base contendo gentamicina em 0,1 mg/mL (adicionar 1 mL de mídia; em seguida, use uma pipeta P1000 ~ 50x para quebrar os iHOs, e adicionar 4 mL de meios adicionais).
- Incubar a 37 ° c durante 1 h para matar bactérias extracelulares.
- Centrifugue os iHOs em 370 x g por 3 min e aspirar o sobrenadante, deixando o mínimo possível. Lave os iHOs 1x com DPBS e centrifugue outra vez.
Nota: Esta etapa remove a gentamicina, que é importante porque toda a gentamicina restante pode matar as bactérias intracelular uma vez que as pilhas são lisadas. - Resuspend os iHOs em 500 μL de tampão de lise (ver tabela de materiais) e dissociar manualmente os organóides por pipetagem ~ 50x. Deixe esta mistura por 5 min em RT.
- Diluir serialmente a solução resultante 10 vezes em DPBS para gerar 10-1, 10-2, e 10-3 concentrações. Pipetas 3 x 20 μL de gotas das soluções puras e diluídas sobre as placas de agar LB pré-aquecido.
- Incubar durante a noite em 37 ° c e realizar contagem de colônias e cálculo das unidades formadoras de colônias (CFU). As contagens de colônias refletirão o número de bactérias intracelulares que foram liberadas durante o processo de lisagem celular.
7. congelamento e recuperação de células
Nota: Como observado anteriormente, é possível preservar criogenicamente iHOs e reconstituí-los quando desejado. Os processos de congelamento e descongelamento estão descritos abaixo.
- Selecione os poços de iHOs que deseja congelar. Adicionar solução de elevação celular aos poços e incubar por 40 – 50 min a 4 ° c. Os iHOs devem estar flutuando na solução.
- Pipetar suavemente os iHOs em um tubo cônico de 15 mL e permitir que eles se instalem. Retire a mídia e lave os iHOs 1x com base de crescimento de mídia (sem fatores de crescimento).
-
Centrifugue a 95 x g durante 2 min, retire o sobrenadante e substitua-o por um volume adequado de meio de congelação celular (consulte a tabela de materiais; utilize o meio de acordo com as instruções do fabricante), decantando os Ihos em frascos criogênicos.
- Armazene os frascos em um congelador de-80 ° c durante a noite para permitir um congelamento mais gradual; em seguida, transferi-los para o armazenamento de nitrogênio líquido.
-
Para reconstituir os iHOs, descongele rapidamente um frasco criogênico a 37 ° c utilizando um banho de água/cordão; em seguida, pipetando suavemente o seu conteúdo em 10 mL de suportes de crescimento base (sem factores de crescimento). Permitir que os iHOs para resolver e substituir a mídia com ~ 300 μL de mídia de crescimento de base fresca.
- Não dissociar manualmente os iHOs. Adicione iHOs à matriz da membrana do porão e placa-os para fora como descrito na seção 3.
Representative Results
Após o início do processo de diferenciação, as células devem passar pelo estágio de formação definitiva de endoderme seguido de padronização do retrointestino antes da incorporação na matriz da membrana basal. Esferóides formarão e culturas com grandes quantidades de material contaminante vai limpar durante um período de várias semanas como os iHOs maduro. Imagens exemplares do processo de diferenciação, incorporação e passagem são mostradas na Figura 1.
A configuração do sistema de microinjeção é conforme demonstrado na Figura 2. Os iHOs são microinjetados com a solução de vermelho/bacteriano de fenol e mantêm sua cor vermelha, permitindo a identificação de iHOs infectados para evitar injeções duplicadas. As contagens de bactérias intracelular chapeadas são executadas depois do ensaio modificado da proteção do gentamicina; prestimulation com rhIL-22 restringe o S. Infecção por typhimurium, com menor número de bactérias intracelulares observadas após tratamento com rhIL-22 (Figura 3). Também rotineiramente processamos iHOs infectados para imunocoloração, ou TEM, a fim de facilitar a visualização das interações IEC-bacterianas hospedeiras (Figura 4).
Figura 1: diferenciação direcionada de iPSCs para iHOs. Seqüência representativa de diferenciação de iPSCs para iHOs, demonstrando as alterações morfológicas observadas e os fatores de crescimento necessários para conduzir essas mudanças. A endoderme definitiva é formada no 4º dia da diferenciação, após a exposição a concentrações específicas de combinações de activina A, FGF, BMP-4, LY294002 e CHIR99021. Após 8 dias, o padronização deste endoderma definitivo com concentrações específicas de CHIR99021 e ácido retinóico resulta em formação de retrointestino. Postincorporação, a formação de esferóide observa-se. Após o passagem sustentado que usa uma matriz suportando da membrana do porão sobreposta com o meio suplementado com os fatores de proliferação prointestinal R-spondin 1, Noggin, EGF, CHIR99021, e prostaglandina E2, os esferoides progridem em Ihos broded. (As imagens foram tiradas na ampliação de 4x-10x). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: microinjeção de um iHO com S. Typhimurium. (A) o sistema de microinjeção (ver tabela de materiais) incluído na câmara ambiental; Isto permite a injeção dos iHOs em um ambiente controlado (37 ° c/5% CO2). (B) o inóculo bacteriano é entregado diretamente no lúmen de Iho usando um microcapilar Unido ao sistema do microinjection. (C) misturando inoculados bacterianos com vermelho de fenol, é claro quais Ihos foram infectados, evitando assim injeções duplicadas da mesma Iho. As imagens foram tiradas em ampliação de 10x. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O pré-tratamento dos iHOs derivados da linhagem celular Kolf2 com rhIL-22 restringe o S. Invasão de typhimurium SL1344 em pilhas epithelial intestinais. Para os ensaios de proteção de gentamicina, os iHOs foram tratados com 100 ng/mL de rhIL-22 18 h antes da infecção, ou deixados sem tratamento, e incubados para 90 min pós-infecção. Os dados são médias de três repetições técnicas para três repetições biológicas ± MEV. Para o teste de significância foram utilizados os testes U de Mann-Whitney; p < 0, 1. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: interação dos IECs com S. typhimurium SL1344. Estes painéis demonstram iHOs injetados com S. Typhimurium SL1344 e incubados por 3 h, antes da fixação e processamento para (A) imunofluorescência ou (B) microscopia eletrônica de transmissão. No painel a, as bactérias são observadas dentro do lúmen Iho e interagem com o epitélio. Os núcleos são manchados com o dilactato de 4 ′, de 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul), de membranas de pilha com faloidina (vermelho), e de bactérias com CSA-1 (verde). As imagens são tiradas em ampliação de 20x. O painel B demonstra três diferentes vias de processamento intracelular de Salmonella após a invasão; as bactérias são vistas (a) dentro de um vacuole contendo da salmonela, (b) livre dentro do citoplasma, e (c) submetendo-se a Autophagy. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
| RPMI/B27 médio | |
| Componente: | Quantidade: |
| RPMI 1640 mídia com suplemento de glutamina | 500 mL de |
| B27 suplemento soro-livre 50x | 10 mL de |
| meio de crescimento base iHO | |
| Componente: | Quantidade: |
| Advanced DMEM/F12 | 500 mL de |
| B27 suplemento soro-livre 50x | 10 mL de |
| N2 soro-suplemento livre 100x | 5 mL de |
| HEPES 1 M | 5 mL de |
| L-glutamina 200 mM | 5 mL de |
| Fatores de crescimento para o meio de crescimento base iHO | |
| Componente: | Quantidade: |
| Humano recombinante R-spondin1 | 500 ng/mL |
| Noggin humano recombinante | 100 ng/mL |
| Fator de crescimento epidérmico (EGF) | 100 ng/mL |
| Prostaglandina E2 | 2,5 μM |
| CHIR99021 | 3 μM |
| Y-27632 monohidrato de dicloridrato | 10 μM |
Tabela 1: receitas de mídia.
Discussion
Este protocolo esboça a diferenciação de hiPSCs em iHOs e em sua utilidade como um modelo em que para simular infecções enteric. Abaixo, nós esboçar as etapas críticas no protocolo e quaisquer modificações ou melhorias que fizemos.
Esse protocolo agiliza o processo de diferenciação dos hiPSCs em relação ao trabalho publicado anteriormente25. Métodos anteriormente utilizados exigiam a transferência de hiPSCs de outros sistemas de cultura hiPSC (por exemplo, cultura hiPSC dependente do alimentador) para meio quimicamente definido – álcool polivinílico (MDL-PVA). Esta transferência para o CDM-PVA normalmente leva de 2 a 3 semanas e requer alimentação diária dos hiPSCs. Este protocolo também não foi consistentemente eficaz, com algumas diferenciações falhando; Conseqüentemente, nós trialed a diferenciação usando os mesmos fatores de crescimento mas começando com os hiPSCs crescidos no meio de cultura da pilha de haste (um pouco do que CDM-PVA) e a recolocação de CDM-PVA com meio de cultura da pilha de haste durante os dias 0 – 3 da diferenciação. Isto foi bem sucedido para as cinco linhas independentes do hiPSC trialed até agora, fazendo o processo da diferenciação muito mais rápido e eficiente. Isso também permite o cultivo livre de fim de semana de hiPSCs antes da diferenciação, permitindo mais flexibilidade na cultura hiPSC. as linhagens de iHO produzidas por este método foram fenotipadas para os marcadores do epitélio intestinal, como descrevemos anteriormente para as linhagens de hiPSC Kolf2, Yemz1 e Lise116 e aparecem fenotipicamente indistinguíveis dos Ihos produzidos com o anterior Protocolo.
Após a semeadura, os iHOs necessitam de pelo menos 1 mês de rotina de passagem, dividindo-se a cada 4 a 7 dias para facilitar a maturação. Note que haverá alguma variação no desenvolvimento de iHO dependendo da linha iPSC usada e da densidade da cultura inicial. Durante as primeiras passagens, haverá células visivelmente contaminantes que não são iHOs. Estes acabará por morrer, deixando uma cultura limpa de esférica e, após cerca de 4 semanas, iHOs broded. Além, um sistema da imagem latente da em-capa pode ser usado para selecionar e para passar somente iHOs com a morfologia desejada. Como os iHOs maduros, eles vão exigir a divisão a cada 6 – 7 dias, dependente da taxa de crescimento e densidade. Se qualquer um dos seguintes ocorrer, os iHOs devem ser divididos antes deste ponto: as cavidades luminais dos iHOs começam a encher-se com as células mortas, a matriz da membrana basal começa a se desintegrar, os iHOs começam a crescer fora da matriz de membrana do porão, ou a cultura é muito densa e a mídia começa a ficar amarela muito rapidamente.
Uma vez que a cultura iHO é estabelecida, se a qualquer momento a aparência dos iHOs muda ou é diferente do que o esperado (por exemplo, as culturas permanecem esféricas, ao invés de brotamento), fenotipagem via imuno-histoquímica e qPCR para marcadores celulares deve ser repetida para garantir que a diferenciação dos tipos de células dentro dos iHOs (por exemplo, células de cálice, células de Paneth) permaneça intacta. Se os iHOs não forem mais diferenciadores, então eles devem ser descartados e rediferenciados ou uma passagem anterior dos iHOs deve ser descongelado e reconstituído. Se os iHOs deixarem de se diferenciar, as causas potenciais são a idade da cultura (se for mais de 6 meses de idade), a atividade dos fatores de crescimento (garantir que estes são reconstituídos de acordo com as instruções dos fabricantes e mantidos congelados em pequenas alíquotas para evitar vários ciclos de congelamento-degelo), passagens muito freqüentes ou violentas (em geral, o passagem só deve ocorrer uma vez por semana, e se os Ihos forem dissociados manualmente com muita força regularmente, eles deixarão de se diferenciar totalmente).
Nós estabelecemos através do sequenciamento de RNA que a estimulação IL-22 18 h antes da infecção upregulates genes antimicrobianos e aqueles envolvidos no phenotype da defesa da barreira. Antes do uso de ihso novo para os ensaios que envolvem o prestimulation com rhil-22 (ou um citocinas alternativo se o sistema está sendo usado para este), é aconselhável verificar a atividade dos genes sabidos para ser upregulated pelo citocinas (no caso de Il-22 , utilizamos DUOX2 e LCN2) via qPCR após estimulação dos Ihos, para garantir a expressão do receptor e sinalização intacta. Antes do primeiro uso da IL-22, também foi realizada imunoistoquímica para localizar o receptor IL-22 em iHOs para estabelecer que a expressão do receptor IL-22 era basal, significando que a prestimulação poderia ser alcançada simplesmente adicionando rhIL-22 à cultura iHO Médio. Entretanto, se um receptor é expressado apically, este protocolo pode ter que ser adaptado para entregar ligantes apically.
As armadilhas relativas ao sistema de microinjeção estão geralmente relacionadas com a delicadeza das agulhas necessárias para a injeção. Aqui, utilizamos pontas de broca comercialmente disponíveis com um lúmen de 6 μm. É possível puxar as agulhas da injeção dos capilares de vidro26 embora isto possa ser menos uniforme, conduzindo às fugas da ponta da agulha ou dos volumes inconsistentes que estão sendo injetados nos Ihos. É importante ter certeza de que a injeção tenha ocorrido no lúmen iHO, que é uma razão para o uso de vermelho fenol como um corante; os iHOs expandirão e segurarão visivelmente o inóculo vermelho, permitindo a certeza de que os iHOs foram injetados. Ocasionalmente as agulhas obstruirão com os restos da parede de iHO; Se este for o caso, retire a ponta da agulha do interior do iHO e pressione o botão Clean no sistema de microinjeção. Isso produzirá um breve período de maior pressão de ar que deve limpar o bloqueio. Ele também irá induzir algum vazamento do inóculo bacteriano sobre a placa; Portanto, se isso ocorrer, a ação de limpeza deve ser repetida em todas as placas para garantir a igualdade de inóculo bacteriano por placa. Uma grande vantagem dos iHOs derivados do hiPSC é o seu tamanho. Organóides intestinais de camundongos e organóides humanos primários são muito menores (medindo até ~ 100 μm e 100 – 300 μm, respectivamente27, versus 250 – 1500 μm para Ihos derivados de hipsc), significando que as injeções de grandes quantidades de organóides serão mais lentas. Isso permite que experimentos de injeção em grande escala sejam triados nos iHOs derivados do hiPSC. Também é possível estudar o conteúdo Luminal dos iHOs colhendo-os pós-infecção e dissociando manualmente os iHOs em DPBS, liberando seus conteúdos luminais. Para a microinjeção, recomendamos o uso de uma alta concentração de bactérias. Verificou-se que as concentrações inferiores não foram suficientes para gerar uma resposta das IECs que compõem os iHOs. Adicionalmente, era difícil encontrar subseqüentemente as bactérias internalizado usando a microscopia. Os inoculums podem ter que ser otimizados para diferentes cepas bacterianas.
Em resumo, os iHOs derivados do hiPSC fornecem um modelo promissor para a dissecação direta da resposta epitelial às infecções entéricas, seja estudando contagens de invasão intracelular, imagens, medindo níveis de citocinas nos sobrenadantes iHO, ou colhendo RNA para alterações transcricionais do estudo após exposição a patógenos. Sua utilidade será ainda mais aparente no futuro para o estabelecimento de modelos de infecção para patógenos de restrição humana e explorando as possibilidades de usar essa tecnologia para personalizar a pesquisa estudando mutações genéticas específicas relacionadas à doença e respostas medicamentosas.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Wellcome Trust, a Fundação Gates, e do centro de pesquisa biomédica Cambridge. E.A.L. é um aluno de doutorado clínico apoiado pelo Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1,000 concentration |
| B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
| Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
| Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
| Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
| Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
| DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
| Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
| Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
| Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
| Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
| EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
| Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
| HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
| KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
| GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
| L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
| Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
| Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3 μM, final concentration 3 mM |
| RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
| Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
| Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |
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