Summary
Hier presenteren we een protocol voor het lokaal opwekken van apicale parodontitis bij muizen. We laten zien hoe we een gat in de tand van de muis boren en de pulp ervan blootstellen, om lokale ontstekingen te veroorzaken. Analysemethoden om de aard van deze ontsteking te onderzoeken, zoals micro-CT en histologie, worden ook aangetoond.
Abstract
De mechanismen die betrokken zijn bij lokale geïnduceerde ontstekingen kunnen worden bestudeerd met behulp van verschillende beschikbare diermodellen. Eén daarvan is de inductie van apicale parodontitis (AP). Apicale parodontitis is een veelvoorkomende pathologie van een ontstekings natuur in de parodontale weefsels rond de tandwortel. Om de aard en het mechanisme van deze pathologie beter te begrijpen, is het voordelig om de procedure bij muizen uit te voeren. De inductie van deze odontogene ontsteking wordt bereikt door het boren in de muis tand totdat de tand pulp wordt blootgesteld. Vervolgens blijft de tand pulp blootgesteld aan besmet door de natuurlijke orale flora na verloop van tijd, waardoor apicale parodontitis. Na deze periode wordt het dier geofferd en kunnen de tand en het kaakbeen op verschillende manieren geanalyseerd worden. Typische analyses omvatten micro-CT-beeldvorming (om botresorptie te evalueren), histologische kleuring, immunohistochemie en RNA-expressie. Dit protocol is nuttig voor onderzoek op het gebied van orale biologie om dit ontstekingsproces beter te begrijpen in een in vivo experimentele setting met uniforme omstandigheden. De procedure vereist een zorgvuldige omgang met de muizen en de geïsoleerde kaak, en een visuele demonstratie van de techniek is nuttig. Alle technische aspecten van de procedures die leiden tot geïnduceerde apicale parodontitis en de karakterisering ervan in een muismodel worden gedemonstreerd.
Introduction
Het doel van deze methode is om apicale parodontitis in een muis te induceren door de Apex te besmetten met de natuurlijke microflora en vervolgens verschillende kenmerken van dit pathologische proces te bestuderen.
Apicale parodontitis (AP) is een veelvoorkomende pathologie van een ontstekings natuur in de parodontale weefsels rond de tandwortel. Deze tandheelkundige aandoening kan ernstige pijn veroorzaken en moet worden behandeld door een tandarts. De behandelingsopties omvatten wortelkanaal behandeling (primair of secundair), endodontische chirurgie, tandextractie, of follow-up afhankelijk van de klinische en radiografische bevindingen, en de mening van de clinicus. Het mechanisme van dit ontstekingsproces, hoewel bestudeerd voor enkele decennia1,2,3, is nog steeds niet volledig begrepen. Gezien de ernst van deze pathologie is er dus een duidelijke behoefte aan onderzoek om de fundamentele aard ervan aan te pakken. Zo zijn systemen waar de studie van AP mogelijk is van groot wetenschappelijk belang.
Aangezien AP een complex pathologisch proces is waarbij de lokale weefsels en het immuunsysteem betrokken zijn, zijn in vitro studies onvoldoende voor een volledig begrip van de processen. Studie van klinische monsters van deze ziekte zijn ook problematisch als gevolg van ethische beperkingen en significante variabiliteit tussen verschillende mensen en verschillende klinische stadia4,5, en vandaar de noodzaak van in vivo modellen. Deze modellen zijn gebaseerd op het concept van het blootstellen van de tand pulp aan verontreiniging en het observeren van de ontstekingsreactie van het lichaam op deze stimulus in de periapicale weefsels6,7. Veelgebruikte modellen in vivo zijn knaagdieren of grotere diersoorten, zoals honden. Ondanks de klinische uitdaging bij de behandeling van muizen, die zeer kleine dieren met miniatuur tanden zijn, zijn de voordelen van het muismodel significant: praktisch is het werken met muizen technisch eenvoudig in termen van faciliteiten en is het meest kosteneffectief, en wetenschappelijk, de muis is een goed bestudeerde diermodel met gemakkelijk beschikbare genetische en moleculaire instrumenten en een goed bestudeerde genoom. Inderdaad, eerdere studies gebruikten een muismodel voor het bestuderen van inflammatoire en bot resorptie signalen en cellen die betrokken zijn bij apicale parodontitis8,9,10,11. Daarom is een duidelijk protocol over het gebruik van een muismodel voor de studie van AP nodig. Hier beschrijven we een dergelijk protocol.
Het hier beschreven protocol heeft het grote voordeel dat het geschikt is om knock-out (ko) muizen te bestuderen en te leren hoe het ontbreken van een specifiek gen de tandheelkundige ontsteking7,12beïnvloedt. Andere nuttige toepassingen van dit protocol zijn onder meer de studie van de effecten van medicatie en systemische condities op de ontwikkeling van apicale parodontitis13, het effect van apicale parodontitis op de ontwikkeling van osteonecrose van de kaken14 , 15 en stamceltherapie voor botregeneratie16.
Dit protocol kan ook worden gegeneraliseerd als een model om lokale ontsteking te bestuderen. Om het ontstekingsproces te bestuderen, zijn verschillende Muismodellen ontwikkeld, waaronder bijvoorbeeld geïnduceerde colitis of artritis17,18. Deze modellen hebben systemische effecten en hebben geen ingebouwde controle in hetzelfde dier. Modellen voor geïnduceerde apicale parodontitis, die een contralaterale controle zonder ontsteking omvatten, hebben het voordeel van het overwinnen van deze beperkingen14,19.
Het hieronder beschreven protocol is daarom nuttig voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in lokale ontstekingsprocessen. De gecontroleerde aard van deze ontsteking, de opsluiting ervan op een specifieke locatie, en de contralaterale controle tand, maken dit protocol allemaal waardevol voor het bestuderen van de mechanismen die bij dit proces betrokken zijn. Bovendien, het protocol is nuttig voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de klinische aspecten van periapicale ontsteking. Het muismodel is ideaal om verschillende variabelen van de ziekte te bestuderen, naast het voordeel dat het gemakkelijk is om genetische manipulaties in het muismodel uit te voeren, om de activiteit van specifieke genen in periapicale ontsteking te onderzoeken.
Technisch gezien is de klinische procedure uitdagend om uit te voeren door de kleine afmetingen van de muizen tanden. Het is nuttig om deze procedure te visualiseren om te leren over positionering, apparatuur die nodig is, en prestaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Hebreeuwse Universiteit (ethisch nr. MD-17-15093-5).
1. dieren anesthesie en positionering
- Bereid steriele oplossingen zoals hieronder beschreven.
- Bereid 5 mL van 7 mg/mL ketamine en 0,09 mg/mL Medetomidine verdund in fosfaat buffer oplossing (PBS)/Saline.
- Bereid een steriele oplossing van Atipamezol (0,4 mg/mL) verdund in PBS/zoutoplossing (aanbevolen om een hoeveelheid van 5 mL te bereiden).
- Bereid een steriele oplossing van Mepivacaine (7,5 mg/mL) verdund in PBS/zoutoplossing voor lokale anesthesie (een meegeleverde flacon Mepivacaine is voldoende voor een voorraad van 7,2 mL).
- Gebruik 6-8 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen voor het experiment. Houd dieren in een specifiek pathogeen vrij (SPF) dier eenheid, met standaard water en voedsel geleverd door de faciliteit en het dier voeden ad libitum.
- Weeg muizen en Injecteer intraperitoneaal (IP) een volume van 10 μL voor elke gram van het gewicht. Bijvoorbeeld, voor een muis die 20 gram weegt,
Injecteer 200 μL ketamine/Medetomidine oplossing. Dit geeft een eindconcentratie van (70 mg/kg) ketamine en (0,9 mg/kg) Medetomidine
voor elk dier. - Om oogulceratie te voorkomen als gevolg van droogheid tijdens de procedure, breng oogzalf met chlooramfenicol (5%) op de ogen van de dieren terwijl ze onder anesthesie. Houd de dieren warm met een lamp terwijl ze verdoiliseerd zijn. Controleer de diepte van de anesthesie door het controleren van pedaal reflex (het uitvoeren van stevige teen knijpen).
- Nadat de muis is verdomd, Positioneer de muis op zijn rechterkant (voor een rechtshandige onderzoeker) op een gesloten-cel geëxtrudeerd polystyreenschuim oppervlak en bevestig de voeten aan het oppervlak met behulp van tape.
- Open de mond met behulp van kleine elastiekjes rond de snijtanden (1 voor de bovenste snijtanden, en 1 voor de onderste snijtanden) die op zijn plaats worden gehouden door lange naalden die zijn vastgemaakt aan het geëxtrudeerde polystyreenschuim oppervlak van de gesloten cellen.
- Trek de rechter wang met behulp van de Tang geplakt naar het oppervlak. Gebruik de Tang die in steady state gesloten zijn.
- Plaats het oppervlak met de muis in een comfortabele werkpositie die toegang tot mandibulaire Molars mogelijk maakt, met behulp van de juiste vergroting (een binoculaire Microscoop of klinische Microscoop) en licht.
- Trek de tong aan met behulp van een tang of tand spatel en Injecteer lokale verdoving met een 27 gauge naald in de mucobuccale plooi grenzend aan de eerste mandibulaire molaire. 25-50 μL volstaat. Zwelling van het weefsel rond de injectieplaats moet worden gevisualiseerd.
2. blootstelling aan pulp
- Gebruik een 1/4 Round Dental Burr, of een zelfde grootte diamant Braam (een lange schacht wordt aanbevolen) met een snelheid van 800 rondes per minuut (rpm), bevestigd aan een geschikte tandheelkundige motor (bijvoorbeeld een automatische koppel reductie (ATR) motor).
- Boor op het occlusale deel van de eerste rechter mandibulaire molaire totdat de pulp hoorns zichtbaar zijn door de dentine. Gebruik korte uitbarstingen van de motor om te voorkomen dat het gebied over-verwarming.
- Gebruik een K-bestand of H-bestand #8 of #10 om de pulp door te boren en voeg het bestand in de pulp hoorns (mesial en distale) door het breken van de dentine die hen bedekt. Bestanden worden gesteriliseerd door autoclaaf.
- Blijf werken met de bestanden in de pulp zo diep mogelijk, terwijl het verbreden van de openingen met de bestanden. Meestal zal er bloeden zichtbaar van de pulp.
- Zorg ervoor dat u de scherpe randen van de tand rond met de Braam en verwijder de tand van occlusie, om pijn tijdens het experiment te verminderen. Reinig vuil tijdens de procedure met een micro borstel.
- Laat de contralaterale tand (linker eerste mandibulaire Molar) als een controle.
3. einde van de klinische procedure
- Laat de muis los van de fixatie status en Injecteer Atipamezole IP (10 μL voor elke gram lichaamsgewicht. Dit geeft een laatste dosis van (4 mg/kg) Atipamezol.
- Injecteer buprenorfine verdund in PBS/Saline (0,05 mg/kg) IP (aanbevolen om een hoeveelheid van 3 mL op de dag van de procedure te bereiden). Zie discussie voor uitleg waarom pijnbestrijding noodzakelijk is.
- Zorg ervoor dat de dieren te herstellen van de anesthesie voor het verlaten van hen. Geef ze zacht voedsel omdat ze mogelijk niet in staat zijn om hard voedsel te eten als gevolg van tandpijn.
4. follow-up van de post procedure (42 dagen)
- Weeg gedurende de eerste 3 dagen na de ingreep de dieren af en Injecteer eenmaal daags een buprenorfine (0,1 mg/kg) IP (aanbevolen om een hoeveelheid van 6 ml te bereiden).
- Gedurende de tijd van het experiment (42 dagen wanneer de ontsteking opbouwt) bewaken van de dieren op gewicht en algemene gedrags beoordeling 2-3 keer per week.
- In de loop van de opvolgings periode zacht voedsel leveren aan de dieren. Bevochtig het voedsel met water en zet het in een petrischaaltje op de vloer van de kooi.
5. beëindiging en analyse van experimenten
- Wanneer 42 dagen11 van follow-up zijn voltooid, anesthetiseren dieren IP met ketamine/xylazine in een concentratie van 106,25 mg/kg ketamine, en 75 mg/kg xylazine (een stamoplossing van 42,5 mg/ml ketamine, en 1,5 mg/ml xylazine in een totaal volume van 2 ml is Aanbevolen) en preform cervicale dislocatie.
Opmerking: er zijn verschillende opties voor mogelijke analyses om de ontsteking te evalueren20,21. Hier wordt de analyse van het weefsel door micro-CT en histologische kleuring beschreven. - Gebruik na euthanasie een chirurgische schaar en een tang om een deel van de kaak te knippen, inclusief de 3 kiezen (afzonderlijk voor elke met de zijkant behandelde en niet-behandelde controle). Door het gebruik van de Tang schil zo veel mogelijk het zachte weefsel, waardoor meestal bot en tanden op het monster.
- Spoel het weefsel kort af in PBS en plaats het vervolgens in Paraformaldehyde (PFA) 4% (verdund in PBS) gedurende 24-48 uur voor fixatie.
Let op: gebruik PFA in een chemische afzuigkap, en volgens de richtlijnen van het materiaal veiligheidsinformatieblad (MSDS). - Na 24-48 uur spoelen met PBS 3x om de PFA te wassen.
- Micro-CT
- Neem voor micro-CT-analyse de geoogste weefsels (een deel van de onderkaak met inbegrip van 3 Molars, in afmetingen van ongeveer 4 mm x 5 MMX 1 mm) naar een micro-CT-scanner, plaats ze in een buis met een diameter van 12 mm, gevuld met 1,5 mL PBS-georiënteerd, zodat de buccale of linguale oppervlakken van de tand en wortel leggen parallel aan de onderkant van de buis. Scheid tussen de monsters met spons, en dek de bovenkant van de buis met flexibele film.
- Open het Scan paneel en kies het meet nummer. Kies het besturingsbestand met de volgende parameters: energie van 70 kV, intensiteit van 114 μA, en resolutie van 6 μm3 Voxel grootte.
- Klik op de Scout-weergaveen wanneer de afbeelding verschijnt, klikt u op referentielijn en markeert u het gebied van de voorbeelden om te scannen. Klik na elk voorbeeld op Scan toevoegen. Wanneer u klaar bent met het markeren van de voorbeelden, gaat u naar de takenlijst en kiest u interactieve taken starten.
Opmerking: dezelfde monsters kunnen vervolgens worden gebruikt voor histologie. Het is belangrijk dat ze niet uitdrogen tijdens de CT-scan.
- Gebruik een geschikt computerprogramma voor micro-CT-uitlijning en-analyse.
- Open het monster op het XY-vlak in de micro-CT-evaluatie. Kies drie punten voor elk voorbeeld voor uitlijning:
De mesiale apicale vernauwing-definieert de oorsprong van het coördinatenstelsel.
Het coronale deel van het mesiale kanaal-definieert een punt op de Z-as.
De distale apicale vernauwing-definieert een punt op het XZ-vlak. - Gebruik het gereedschap meten in het linkerdeelvenster en teken een lijn die elk punt bereikt. Definieer elk van de drie punten met een X, Y & Z-waarde, zoals deze in het rechterdeelvenster wordt weergegeven.
- Definieer het interessegebied in het voorbeeld door taak onder μct-evaluatiete kiezen en klik op 3D-evaluatie. Op het scherm verschijnt een rechthoek en een venster met de afmetingen per as. Overeenkomen met de afmetingen van de rechthoek aanpassen aan het gebied van belang op de XY-as door te klikken in de hoeken met de middelste knop van de muis. Kies de dimensies in de Z-as door het eerste Segmentnummer van de belangstelling in het Z-kwadraat onder VOI-startin te voegen en het aantal segmenten van de eerste tot het laatste Segmentnummer van de belangstelling in het z-vierkant onder Dim.
- Klik op toepassingen onder Session Manager, en kies decterm. Wacht een paar seconden tot een venster is geopend en typ vervolgens de vijf stappen van het schuine script dat hieronder wordt beschreven volgens de volgende instructies (tussen de regels op Enter):
Ipl
isq_to_aim
aim1 - Kopieer de naam van de ISQ (bestand van belang): Kies ' views ' onder Session Manager en klik op microctdata. Zoek het bestand waaraan u werkt en klik in het midden op het bestand. Klik vervolgens midden op terug in het venster van de DECterm.
- Voer de X, Y & Z waarden (met een spatie daartussen) die zijn bepaald onder VOI bij het kiezen van regio van belang.
- Voer de X, Y & Z waarden (met een spatie daartussen) die zijn bepaald onder Dim bij het kiezen van regio van belang.
- Wacht tot een bericht wordt ontvangen: ISQ om te richten voltooid.
(stap II-uitlijning):
uitlijnen z
aim1
aim2 - Voer de X-, Y & Z-waarden in (met een spatie daartussen) die voor de oorsprong van het coördinatensysteem zijn vastgesteld.
- Voer de waarden X, Y & Z in (met een spatie daartussen) die voor het punt op de Z-as zijn bepaald.
- Voer de X-, Y & Z-waarden in (met een spatie daartussen) die voor het punt op het XZ-vlak zijn bepaald.
- Wacht tot een bericht wordt ontvangen: "align_Z completed"
(stap III-koptekst):
Header
aim2
0 0 0
0 0 0 - Klik op Enter.
(Stap IV-converteren van het bestand terug van AIM naar ISQ):
toisq
aim2 - Kopieer de naam ISQ (bestand van belang): Kies ' bekeken ' onder ' sessiebeheer ' en klik op ' microct-gegevens'. Zoek het bestand waaraan u werkt en klik in het midden op het bestand. Klik vervolgens midden op terug in het venster van de DECterm. Wissen (met "Backspace") de ". ISQ "aan het einde van het bestand en schrijf:" _new. ISQ "om het uitgelijnde bestand te herkennen.
- Klik op Enter | invoeren.
- Wacht tot een bericht wordt ontvangen: "toisq_from_aim completed"
(stap V-Flip):
Isq
A - Kopieer de nieuwe naam ISQ (bestand met interesse): Kies ' bekeken ' onder ' sessie beheer ' en klik op ' microct-gegevens'. Zoek het bestand waaraan u werkt en klik in het midden op het bestand. Klik vervolgens midden op terug in het venster van de DECterm.
- Klik op Enter | invoeren. Wachten om een bericht te ontvangen: "isq_to_aim completed"
Flip
A
Aa
Zx
wachten om een bericht te ontvangen: "flip_aim completed"
Van
Aa - Kopieer de nieuwe ISQ-naam: Kies ' views ' onder Session Manager en klik op microct data. Zoek het bestand waaraan u werkt en klik in het midden op het bestand. Klik vervolgens midden op terug in het venster van de DECterm. Wissen (met "Backspace") de ". ISQ "aan het einde van het bestand en schrijf:" _flip. ISQ "om het uitgelijnde bestand te herkennen.
- Wacht tot een bericht wordt ontvangen: "from_aim_to_isq completed"
- Open het monster op het XY-vlak in de micro-CT-evaluatie. Kies drie punten voor elk voorbeeld voor uitlijning:
- Contouring
- Kies het segment dat ongeveer het midden van de tand vertegenwoordigt, waarin de coronale pulp, radiculaire pulp van beide kanalen en beide apicale foramens worden weergegeven.
- Markeer de contour van de interesse handmatig op de middelste slice door te klikken op de linker contour panel-beginnend vanaf het distale punt van de distale wortel Apex Mark de apicale grens kronkelig aan het radiopaque apicale gebied, door de mesiale rand van de mesiale wortel Apex na de distale grens van de mesiale wortel en de mesiale grens van de distale wortel door de furcatie regio (Zie Figuur 3 II, IV).
- Kopieer deze contour (CTRL + C, CTRL + V) en pas deze vervolgens aan op 5 segmenten die aan beide zijden van het middelste segment zijn geplaatst.
- Voor het berekenen van het weefsel volume van de contour gemarkeerd voor elk monster Kies taak onder μct evaluatie, en klik op 3D-evaluatie. Klik in het venster van 3D-evaluatie op selecteren in de buurt van taak en kies een filter om het weefsel volume (TV) te berekenen.
- Histologie
- Nadat de weefsels uit de micro-CT-scanner zijn verwijderd, ontheft u de weefsels door elk monster in een micro centrifugebuis te zetten met 1 mL ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) 0,5 M pH 8,0 gedurende 10 dagen. Verander de EDTA-oplossing elke 3 dagen.
- Uitdroging: steek monsters in histologische cassettes en in toenemende ethanol concentraties, elk een uur, als volgt: 70% ethanol (op dit punt kan het proces gedurende enkele weken worden stopgezet, zolang de monsters in ethanol worden gehouden), 90% ethanol 2x, 100% ethanol 2x, xyleen 2x (Let op: gebruik xyleen in een chemische afzuigkap, en volgens de richtlijnen van de MSDS).
- Breng cassettes over in vloeibare paraffine (60 °C) en laat de chemische afzuigkap 's nachts voor het xyleen verdampen.
- Blokkeren: gebruik een histologische blokkerende machine om de monsters in te bedden in paraffine. Wees voorzichtig om ze in een juiste positie in te bedden (dat wil zeggen, de kroon en wortels moeten parallel aan het onderste deel van de mal worden georiënteerd, op een manier dat de tand "liggend" is) om sagittale secties te krijgen. De monsters zijn nu klaar om te worden gesneden met een microtoom.
- Snijden van de secties: begin met het snijden van dikke plakjes ~ 20 μm tot het relevante deel van het weefsel te bereiken. Zodra het herkennen van een deel van de tand (kroon of wortels) veranderen in secties van 6 μm, en verander de hoek van snijden volgens de vorige sectie.
- Bijvoorbeeld, als de vorige sectie bevatte de kroon maar niet de wortels, verander de hoek van het blok in de microtoom, zodat de wortels dichter bij het mes komen, en de kroon gaat terug (de delen van de tand kan worden herkend met een blote oog op het blok zelf).
- Blijf de hoek aanpassen tot het verkrijgen van sagittale secties met inbegrip van coronale en radiculaire pulp, en de apicale foramen. Snijd in deze richting zoveel mogelijk plakjes, totdat het relevante weefsel is gesneden.
- Voor kleurings protocollen (bijv. hemotoxylin en eosine kleuring (H & e), bruin & Brenn kleuring, tartraat-resistente zure fosfatase (val) kleuring, immunohistochemie), Zie20,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een stroomschema van de experimentele stappen wordt weergegeven in Figuur 1. Zoals vermeld in het Protocol, de muizen zijn verdouild, en hun eerste mandibulaire molaire aan de ene kant wordt geboord tot de blootstelling aan pulp, terwijl de contralaterale tand wordt achtergelaten als een controle. Vervolgens worden de tanden gelaten om te worden verontreinigd door de orale flora voor 42 dagen, waarin ze worden bewaakt en krijgen pijnmedicatie. Na 42 dagen worden muizen geëerd en worden de tanden en de aangrenzende kaak voor analyse genomen.
Figuur 2 toont klinische beelden van de muis onderkaak na de eerste juiste molaire pulp blootstelling. In Figuur 2a wordt de gehele onderkaak getoond, terwijl de inzet in Figuur 2b een uitbreiding van de behandelde eerste rechter molaire toont. De linker eerste molaire wordt gebruikt als een controle. De blootstelling van zowel mesiale als distale pulp hoorns en de toegang tot de kanalen is te zien in Figuur 2b. Merk op dat de tand mechanisch werd verlaagd tot subocclusie om pijn te verminderen.
Na tandheelkundige pulp blootstelling aan de orale flora, de tandheelkundige pulp uiteindelijk besmet6,7 en wordt necrotisch. Volgens de literatuur22, gram negatieve bacteriën vervolgens afscheiden lipopolysaccharide (LPS) naar de apicale regio van de tand. Door een complexe reactie van het immuunsysteem, een van de uitkomsten is botresorptie in de periapicale regio, dat is het kenmerk van apicale parodontitis23. Deze botresorptie kan worden geïdentificeerd en gekwantificeerd door micro-CT. In micro-CT-beelden geven radiolucent periapicale gebieden gebieden aan waar het harde botweefsel een zachte periapicale laesie werd vanwege het ontstekingsproces. In Figuur 3tonen representatieve micro-CT-beelden een behandelde tand in vergelijking met een besturingselement. De pijl in Figuur 3aIII wijst op de blootstelling aan mesiale pulp (de distale pulp blootstelling verschijnt niet op dit deel van het monster) en de mesiale en distale periapicale radiolucent gebieden van botresorptie worden omgeven door een onderbroken lijn. Een Boxplot grafiek die hier wordt getoond, kwantificeert de significante periapicale botresorptie in de behandelde tanden in vergelijking met de besturingselementen.
Hoewel micro-CT een uitstekende techniek is voor de evaluatie van de 3-dimensionale grootte van de laesies, ontbreekt het informatie met betrekking tot hun biologische samenstelling. Histologische kleuring, zoals weergegeven in Figuur 4, verschaft deze informatie. H & E kleuring wordt aangetoond in een controle tand in vergelijking met een behandelde tand. In de behandelde tand (figuur 4b, C, D) presenteert de tandheelkundige pulp zelf necrose die duidelijk kan worden gezien in de H & E kleuring (figuur 4c), vergeleken met de controle georganiseerd pulp weefsel (figuur 4a). Bovendien, en belangrijk, in de periapicale gebied van de behandelde tand een periapicale laesie, samengesteld uit immuuncellen (dominant macrofagen en lymfocyten), wordt gevisualiseerd (figuur 4D) (in vergelijking met de gezonde periodontale ligament (PDL) en botweefsel in de periapicale regio van de controle tand). Deze periapicale laesie is het gewenste resultaat van de geïnduceerde apicale parodontitis-techniek die hier wordt gepresenteerd.
Aan de andere kant presenteert Figuur 5 een mislukte besmetting die in zeldzame gevallen kan voorkomen (ten minste 85% van de dieren vertonen botresorptie in de micro-CT), d.w.z. een tand die gedurende 42 dagen aan de orale flora werd blootgesteld, maar geen pulp necrose en daarom niet aangetoond botverlies en periapicale laesie in de micro-CT (figuur 5a) en histologische (Figuur 5b) analyses.
Figuur 1: tijd-as van het experimentele proces. Schematische weergave van de temporele progressie van de experimentele procedure. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: klinische beelden van muis onderkaak na juiste eerste molaire pulp blootstelling. A) muis onderkaak, eerste rechter molaire met blootgestelde pulp, eerst links molaire dient als een onbehandelde controle. B) vergroting van de rechter molaire met de blootgestelde pulp. De toegang tot de grachten kan worden gevisualiseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: micro-CT-analyse. A) representatieve micro-CT-scans (schijfjes van 6μm) van behandelde (AIII, AIV) en controle (AI, AII) tanden. Pijlpunten bij blootstelling aan mesial pulp (distale pulp blootstelling is niet aanwezig in dit segment). Mesiale en distale periapicale gebieden van botverlies grenzend aan de behandelde tand worden omgeven door onderbroken lijnen. AII, AIV-representatieve afbeeldingen van contourmarkering. B) vak-plot kwantificeren van het weefsel volume (gemeten met de contour gemarkeerd voor 11 sneetjes van elk monster) van de controle (oranje, n = 14 dieren) in vergelijking met de behandelde (blauwe, n = 15 dieren) monsters. De analyse werd uitgevoerd met behulp van de Scanco evaluatiesoftware voor micro-CT. samples werden op de sagittale as gericht op een manier waarop de coronale pulp, wortelkanalen en apicale foramen in hetzelfde segment werden gevisualiseerd (zie protocol voor gedetailleerde informatie over oriëntatie). Contouren werden gemarkeerd voor 5 plakjes aan weerszijden van de mid-tooth gebied (allemaal samen 11 segmenten). Het weefsel volume voor de contour van elk monster werd berekend met behulp van de software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: histologische H &Amp; E representatieve beelden: (a) histologisch segment van een controle tand. B) histologisch segment van een behandelde tand, met een ernstige periapicale laesie gepresenteerd. C) uitbreiding van necrotisch weefsel. D) uitbreiding van het periapicale granuloom-weefsel P = pulp, D = dentine, B = bot, BM = beenmerg, PDL = periodontale ligament, N = necrotische pulp, G = granuloom. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: voorbeeld van mislukte besmetting: (a) micro-CT representatief beeld van een tand met blootstelling aan pulp (witte pijl), maar geen significant Periapicaal botverlies, gecorreleerd aan (B) histologisch H & E representatief beeld van dezelfde tand die vitale (geen necrotische) pulp en normale apicale weefsels onthult. P = pulp, D = dentine, B = bot, BM = beenmerg, PDL = periodontaal ligament. C) vergroting van het verkalkte weefsel, gepresenteerd in B. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een methode geïntroduceerd voor de inductie van apicale parodontitis bij muizen. Het doel van de methode is om de apicale parodontitis voorwaarde voor het bestuderen van mechanismen en gevolgen van dit ontstekingsproces te exploiteren. Apicale parodontitis werd geïnduceerd in 6-8 weken oude muizen, een leeftijd waarin de wortels volledig zijn ontwikkeld24. Om apicale parodontitis in dit model te veroorzaken, wordt de tand pulp van muis mandibulaire kiezen blootgesteld met behulp van een tandheelkundige Braam. Bacteriën uit de orale flora van de muizen (in SPF-omstandigheden) dringen de pulp-en wortelkanalen van de tanden binnen, veroorzaken pulp necrose en scheiden LP'S naar de apicale weefsels, die apicale ontstekingen trigeren.
Let bij het uitvoeren van deze procedure op deze volgende kritieke stappen. De juiste positionering van de dieren tijdens de blootstelling aan pulp is van cruciaal belang voor het welslagen van de procedure. Een kritieke stap is de juiste blootstelling van de pulp. Onvoldoende kanaal blootstelling kan resulteren in een dentine brug vorming, wat kan leiden tot het falen van de procedure en het onvermogen om AP te creëren. Tijdens de blootstelling aan pulp is aandacht nodig om letsel van zacht weefsel tijdens de blootstelling aan pulp te minimaliseren, om ongewenste pijn en ontstekingen in andere gebieden te voorkomen die bijwerkingen kunnen veroorzaken. De juiste uitlijning van de samples in de micro-CT-analyse software is van cruciaal belang om interpretabel resultaten te verkrijgen. Bij de bereiding van het kaakweefsel voor histologie, is het aanbevolen om het zachte weefsel rond het bot te schillen om de juiste oriëntatie te bereiken bij het bereiden van mallen voor histologie. De monsters moeten gedurende het gehele proces (vanaf de oogst fase, via de micro-CT, tot aan de histologische blok procedure) in nat medium worden gehouden. Bij het snijden van het weefsel in een microtoom, moet de hoek van het monster worden vastgesteld om sagittale plakjes van de tand te bereiken. Het is ook belangrijk om rekening te houden met ethische kwesties met betrekking tot het welzijn van de dieren. Bijvoorbeeld, goede anesthesie is van cruciaal belang tijdens de procedure (zowel systemisch en lokaal, Zie25,26). Pijnmedicatie is essentieel, vooral voor de eerste paar dagen na de procedure, en het monitoren van gewicht en gedrag, evenals een levering van de dieren met zacht voedsel moet worden uitgevoerd. Uit eerdere ervaring, de algehele reactie van de muizen is om goed te tolereren de procedure en ze vertonen geen extreme nood.
Een storing van de methode wordt overwogen in gevallen waarin een apicale ontsteking niet vorm heeft: er is geen bewijs voor botresorptie in het periapicale gebied van de tand op de micro-CT-scan, en het PDL-weefsel van de tand is intact in histologische kleuring (zoals weergegeven in Figuur 5). De mogelijke redenen voor het niet bereiken van ontstekingen omvatten stochastische verschillen in het gedrag van de dieren evenals de specifieke blootstelling van elk dier aan bacteriën. Hoewel goede resultaten worden bereikt bij het veroorzaken van apicale parodontitis met behulp van deze methode (ten minste 85% van de dieren vertonen botresorptie), volg het protocol nauw om elke variatie tussen de monsters te verminderen. Als muizen tekenen van nood vertonen tijdens de follow-upperiode, overweeg dan om ze uit het experiment te verwijderen om leed te voorkomen. De beslissing om dit te doen kan worden geholpen door te kijken naar het verlies of de gewichtstoename van de dieren tijdens de follow-upperiode. Dieren die veel gewicht verliezen lijden en moeten worden verwijderd. We hebben ook geconstateerd dat de dieren die het meest lijden, degenen zijn die het experiment begonnen met een laag gewicht of een slechte gezondheidstoestand. Over het algemeen moet de procedure, indien correct uitgevoerd, consistente resultaten opleveren.
Verschillende beperkingen van deze techniek moeten worden opgemerkt. Het is belangrijk op te merken dat dit model is ontwikkeld om apicale parodontitis veroorzaakt door bacteriële besmetting te bestuderen en niet nabootsen van verschillende andere mogelijke mechanismen waardoor apicale parodontitis kan ontstaan, zoals traumatisch letsel en auto-inflammatoire ziekte. Bovendien bestaan er aanzienlijke verschillen tussen dit model en de klinische situatie bij menselijke patiënten. Bij muizen zijn spontane periapicale laesies niet beschreven en dit is volledig een kunstmatige situatie. De anatomie van knaagdieren verschilt ook van die van de mens; het belang van deze verschillen is onbekend. Niettemin, de muis is een zeer nuttig model voor het begrijpen van basismechanismen en verschijnselen. Bovendien, een wortelkanaal genezing model in een muis (door te behandelen met een wortelkanaal) is niet gemeld tot nu toe, maar potentieel heeft een groot belang op dit gebied van onderzoek moet het haalbaar blijken te zijn. Er is een methode voor het afdekken van pulp gerapporteerd voor muizen, die een groot potentieel van27vertoont. Een wortelkanaal genezings model is inderdaad onlangs ontwikkeld in ratten, een model dier vaak gebruikt in endodontisch onderzoek28. De hier gerapporteerde methode kan dienen als een voorbereidende procedure voor het ontwikkelen van dit wortelkanaal genezings model.
Het gebruik van een in vivo-methode is cruciaal voor de studie van een dergelijke complexe immuunreactie, en een muismodel, hoewel klinisch uitdagend vanwege de geringe omvang van het dier, heeft vele voordelen: het is kostenbesparend, omvat gemakkelijk toegankelijke faciliteiten en een set van beschikbare genetische en moleculaire hulpmiddelen (zoals beschikbare knock-outs, CRISPR-bibliotheken en een veelheid aan genomische gegevens). Dit model is het meest geschikt voor endodontisch onderzoek, omdat het de klinische presentatie van AP in steriele laboratoriumomstandigheden induceert, met minimale variaties (in tegenstelling tot klinische studies). Bovendien, dit model heeft ook voordelen in andere onderzoeksgebieden, zoals chronische ontsteking, als gevolg van de mogelijkheid om een chronische maar lokale ontsteking met minimale systemische betrokkenheid veroorzaken, en het gebruik van de contralaterale kant van hetzelfde dier als een controle.
Dit werk rapporteert het gebruik van micro-CT en histologie voor analyse van de laesie. Mogelijk kunnen andere soorten analyses worden gebruikt in dit model die hier niet werden uitgevoerd, zoals het isoleren van DNA en het testen van DNA-methylatie op verschillende genen in de ontstekingscellen; het isoleren van RNA en het uitvoeren van RNA-SEQ om het patroon van genexpressie in verschillende immuuncellen of verschillende soorten muizen te zien; cellen te isoleren of te karakteriseren door FACS20,21,29. Collectief, er is een groot potentieel in het model gerapporteerd hier, die hopelijk zal worden vergemakkelijkt door deze gerapporteerde protocol en demonstratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
We willen Dr. Oded Heyman graag erkennen voor zijn hulp bij het positioneren van dieren, Raphael Lieber voor hulp bij micro-CT-analyse, en Prof. Andiara de Rossi Daldegan voor advies over de voor vorming van het experiment. Ook willen we Dr. Sidney Cohen erkennen voor kritisch lezen en bewerken.
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het Dr. Izador I. Cabakoff Research Endowment Fund aan MK en IA, en een Yitzhak Navon Fellowship van het Israëlische ministerie van wetenschap en technologie aan bv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Eurovet Animal Health | CAS 104075-48-1 | |
| ATR | dentsply | tecnika | |
| blocking machine | Leica | EG1150H | |
| buprenorphine | vetmarket | 163451 | |
| clinical microscope/binocular | Olympus | Sz61 | |
| dental bur | Komet dental | ZR8801L 315 008 | |
| dental spatula | Premier | 1003737 | |
| EDTA | J.T Baker | 8993 | |
| entelan | mercury | 1.07961 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | SIGMA | HT110116 | |
| hematoxylin solution, Mayer's | SIGMA | MHS 16 | |
| Ketamine hydrochloride | Vetoquinol | CAS 1867-669 | |
| Medetomidine hydrochloride (cepetor) | CP-pharma GmbH | CAS 86347-15-1 | |
| Mepivacaine HCl 3% | Teva | CAS 96-88-8 | |
| microbrushes- adjustable precision applicators | PARKELL | S379 | |
| micro-ct scanner | scanco | uCT 40 | |
| parafin | Leica | 39602004 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| PFA | EMS | 15710 | |
| Chloramphenicol eye ointment (5%) | Rekah pharmaceutical | CAS 56-75-7 | |
| tweezers | WAM | Ref-CT | |
| xylazine | Eurovet Animal Health | CAS 7361-61-7 | |
| xylene | Gadot | CAS 1330-20-7 |
References
- Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
- Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
- Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
- Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
- Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
- Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
- Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
- Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
- Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
- Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
- De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
- Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
- Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
- Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
- Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
- Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
- Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
- Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
- Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
- Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
- Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
- Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
- Metzger, Z.
- Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
- Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
- Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
- Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
- Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
- AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).
