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Biology

चूहे में एपिकल पीरियडों को प्रेरित करना

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59521
Automatic Translation
1,2, 1, *2, *1
1Institute of Dental Sciences, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Endodontics, Hadassah Ein Kerem Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम चूहों में स्थानीय रूप से शीर्ष periodontitis प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम बताते हैं कि कैसे माउस के दांत में एक छेद ड्रिल और इसके लुगदी का पर्दाफाश करने के लिए, क्रम में स्थानीय सूजन पैदा करने के लिए. इस सूजन की प्रकृति की जांच करने के लिए विश्लेषण विधियों, जैसे माइक्रो-सीटी और हिस्टोलॉजी, का प्रदर्शन भी किया जाता है।

Abstract

स्थानीय प्रेरित सूजन में शामिल तंत्र कई उपलब्ध पशु मॉडल का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है. इनमें से एक शीर्ष पत्रिका (एपी) का प्रेरण है। एपिकल पीरियडॉन्टाइटिस दांत की जड़ के आसपास के periodontal ऊतकों में एक भड़काऊ प्रकृति का एक आम विकृति है। इस विकृति की प्रकृति और तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए चूहों में प्रक्रिया करना फायदेमंद है। इस odontogenic सूजन के प्रेरण माउस दांत में ड्रिलिंग द्वारा हासिल की है जब तक दंत लुगदी उजागर है. इसके बाद, दांत का पल्प समय के साथ प्राकृतिक मौखिक वनस्पति यों द्वारा दूषित होने के संपर्क में रहता है, जिससे शीर्ष periodontitis होता है। इस समय अवधि के बाद, जानवर का बलिदान किया जाता है, और दांत और जबड़े की हड्डी का विभिन्न तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है। विशिष्ट विश्लेषणों में माइक्रो-सीटी इमेजिंग (हड्डी पुनर्शोषण का मूल्यांकन करने के लिए), हिस्टोलॉजिकल धुंधला, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, और आरएनए अभिव्यक्ति शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल मौखिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए बेहतर एक समान शर्तों के साथ एक vivo प्रयोगात्मक सेटिंग में इस भड़काऊ प्रक्रिया को समझने के लिए उपयोगी है. प्रक्रिया चूहों और अलग जबड़े की एक सावधान हैंडलिंग की आवश्यकता है, और तकनीक का एक दृश्य प्रदर्शन उपयोगी है. प्रेरित शीर्ष periodontitis के लिए अग्रणी प्रक्रियाओं के सभी तकनीकी पहलुओं और एक माउस मॉडल में इसकी विशेषता का प्रदर्शन कर रहे हैं.

Introduction

इस विधि का लक्ष्य प्राकृतिक माइक्रोफ्लोरा के साथ शीर्ष को दूषित करके, और फिर इस रोग जनक की विभिन्न विशेषताओं का अध्ययन करके माउस में शीर्ष periodontitis को प्रेरित करना है।

एपिकल periodontitis (एपी) दांत जड़ के आसपास periodontal ऊतकों में एक भड़काऊ प्रकृति का एक आम विकृति है। यह दंत रोग गंभीर दर्द पैदा कर सकता है और एक दंत चिकित्सक द्वारा इलाज किया जाना चाहिए। उपचार के विकल्प रूट कैनाल उपचार (प्राथमिक या माध्यमिक), endodontic सर्जरी, दांत निष्कर्षण, या नैदानिक और रेडियोग्राफिक निष्कर्षों के आधार पर अनुवर्ती, और चिकित्सक की राय शामिल हैं. इस भड़काऊ प्रक्रिया की व्यवस्था, हालांकि कई दशकों के लिए अध्ययन किया1,2,3, अभी भी व्यापक रूप से समझ में नहीं आ रहा है. इस विकृति की गंभीरता को ध्यान में रखते हुए, इस प्रकार अनुसंधान के लिए एक स्पष्ट आवश्यकता है जो इसके मौलिक प्रकृति को संबोधित करता है। इस प्रकार, सिस्टम जहां एपी का अध्ययन संभव है महान वैज्ञानिक हित के हैं.

चूंकि एपी स्थानीय ऊतकों और प्रतिरक्षा प्रणाली को शामिल एक जटिल रोग प्रक्रिया है, इन विट्रो अध्ययन प्रक्रियाओं की पूरी समझ के लिए अपर्याप्त हैं। इस रोग के नैदानिक नमूनों का अध्ययन भी नैतिक सीमाओं और विभिन्न लोगों और विभिन्न नैदानिक चरणों के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता के कारण समस्याग्रस्त हैं4,5, और इसलिए विवो मॉडल में की आवश्यकता. ये मॉडल दंत पल्प को संदूषण के लिए उजागर करने और शरीर की सूजन प्रतिक्रिया को पेरिएपिकल ऊतकों6,7में इस उत्तेजना के लिए देखने की अवधारणा पर आधारित हैं . विवो मॉडल में आम में कृन्तक या बड़े जानवर जैसे कुत्ते शामिल होते हैं। चूहों के इलाज में नैदानिक चुनौती के बावजूद, जो लघु दांतके साथ बहुत छोटे जानवर हैं, माउस मॉडल के फायदे महत्वपूर्ण हैं: व्यावहारिक रूप से, चूहों के साथ काम करना सुविधाओं के मामले में तकनीकी रूप से सरल है और सबसे अधिक लागत प्रभावी है, और वैज्ञानिक रूप से, माउस आसानी से उपलब्ध आनुवंशिक और आणविक उपकरणों और एक अच्छी तरह से अध्ययन जीनोम के साथ एक अच्छी तरह से अध्ययन किया पशु मॉडल है. वास्तव में, पिछले अध्ययनों में भड़काऊ और हड्डी पुन: अवशोषण संकेतों और शीर्ष periodontitis8,9,10,11में शामिल कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक माउस मॉडल का इस्तेमाल किया . इसलिए, कैसे एपी के अध्ययन के लिए एक माउस मॉडल का उपयोग करने पर एक स्पष्ट प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. यहाँ, हम इस तरह के एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल नॉक आउट (KO) चूहों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त होने का बड़ा लाभ है और जानने के लिए कैसे एक विशिष्ट जीन की कमी दंत सूजन को प्रभावित करता है7,12. इस प्रोटोकॉल के अन्य उपयोगी अनुप्रयोगों में शीर्ष periodontitis13के विकास पर दवाओं और प्रणालीगत स्थितियों के प्रभाव का अध्ययन , जबड़े14 के ऑस्टियोनेक्रोसिस के विकास पर शीर्ष पत्रिका का प्रभाव शामिल है , 15 और हड्डी पुनर्जनन के लिए स्टेम सेल थेरेपी16.

इस प्रोटोकॉल भी स्थानीय सूजन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में सामान्यीकृत किया जा सकता है. सूजन प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, कई माउस मॉडल विकसित किए गए हैं, जिनमें उदाहरण के लिए प्रेरित कोलाइटिस या गठिया17,18शामिल हैं। इन मॉडलों प्रणालीगत प्रभाव है और एक ही जानवर में कोई निर्मित नियंत्रण है. प्रेरित शीर्ष periodontitis के लिए मॉडल, जो सूजन के बिना एक contralateral नियंत्रण शामिल हैं, इन सीमाओं पर काबू पाने का लाभ है14,19.

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल इसलिए स्थानीय भड़काऊ प्रक्रियाओं में रुचि रखते हैं, जो शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है. इस सूजन के नियंत्रित प्रकृति, एक विशिष्ट स्थान पर इसकी कैद, और contralateral नियंत्रण दांत, सभी इस प्रक्रिया में शामिल तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल मूल्यवान बनाते हैं. इसके अलावा, प्रोटोकॉल periapical सूजन के नैदानिक पहलुओं में रुचि शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है. माउस मॉडल आसानी से माउस मॉडल में आनुवंशिक जोड़तोड़ प्रदर्शन करने में सक्षम होने के लाभ के अलावा, रोग के विभिन्न चर का अध्ययन करने के लिए आदर्श है, periapical सूजन में विशिष्ट जीन की गतिविधि की जांच करने के लिए.

तकनीकी तौर पर, चूहों के दांतों के छोटे आयामों के कारण नैदानिक प्रक्रिया को पूरा करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। यह स्थिति, उपकरण की जरूरत है, और प्रदर्शन के बारे में जानने के क्रम में इस प्रक्रिया कल्पना करने के लिए फायदेमंद होगा।

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों हिब्रू विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है (नीति नहीं. एमडी-17-15093-5).

1. पशु संज्ञाहरण और स्थिति

  1. बाँझ समाधान तैयार के रूप में नीचे वर्णित है.
    1. केटामाइन के 7 मिलीग्राम/एमएल का 5 एमएल और फास्फेट बफर घोल (पीबीएस)/सेलीन में पतला 0.09 मिलीग्राम/एमएल मेडेटोमीडीन तैयार करें।
    2. पीबीएस/सेल में पतला एटिपामेज़ोल (0.4 मिलीग्राम/एमएल) का बाँझ समाधान तैयार करें (5 एमएल की राशि तैयार करने के लिए अनुशंसित)।
    3. स्थानीय संज्ञाहरण के लिए पीबीएस/सेलिन में पतला मेपिवैकेन (7.5 मिलीग्राम/एमएल) का बाँझ समाधान तैयार करें (मेपिवैकेन की आपूर्ति की गई शीशी 7.2 एमएल के स्टॉक के लिए पर्याप्त है)।
  2. प्रयोग के लिए 6-8 सप्ताह पुरानी मादा C57BL/ एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) पशु इकाई में जानवरों को रखें, सुविधा और पशु खिला विज्ञापन libitum द्वारा प्रदान की मानक पानी और भोजन के साथ।
  3. चूहों वजन और वजन के प्रत्येक ग्राम के लिए intraperitoneally (आईपी) की एक मात्रा 10 डिग्री सेल्सियस की एक मात्रा सुई। उदाहरण के लिए, एक माउस है कि 20 ग्राम वजन के लिए,
    केटामाइन/मेडेटोमीडिन समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस इंजेक्ट करें। यह एक अंतिम एकाग्रता दे देंगे (70 mg/kg) Ketamine और (0.9 mg/kg) Medetomidine
    प्रत्येक जानवर के लिए.
  4. प्रक्रिया के दौरान सूखापन के कारण आंख अल्सर को रोकने के लिए, Chloramphenicol युक्त आंख मरहम लागू (5%) जानवरों की आँखों पर जब वे संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं। जानवरों को दीपक से गर्म रखें, जबकि वे एनेस्थेटाइज्ड होते हैं। पेडल पलटा (प्रदर्शन फर्म टो चुटकी) की जाँच करके संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें।
  5. माउस के बाद anesthetized है, एक बंद सेल extruded polystyrene फोम सतह पर अपने दाईं ओर (एक दाएँ हाथ शोधकर्ता के लिए) पर माउस बिछाने की स्थिति और टेप का उपयोग कर सतह के लिए पैर देते हैं.
  6. बंद सेल extruded polystyrene फोम सतह में टिकी लंबी सुइयों द्वारा जगह में आयोजित छेदक के आसपास छोटे रबर बैंड का उपयोग करके मुंह खोलें (1 ऊपरी छेदक के लिए, और कम छेदक के लिए 1) जगह में आयोजित.
  7. सतह पर टेप किए गए संदंश का उपयोग करके दाएं गाल को वापस लें। स्थिर अवस्था में बंद सम्पका उपयोग करें.
  8. उचित आवर्धन (एक दूरबीन माइक्रोस्कोप या नैदानिक माइक्रोस्कोप) और प्रकाश का उपयोग कर, mandibular मोलर के लिए उपयोग को सक्षम करने के लिए एक आरामदायक काम की स्थिति में माउस के साथ सतह प्लेस.
  9. संदंश या दंत स्पैचुला का उपयोग करके जीभ को वापस लें और पहले मैंडिबुलर मोलर के निकट म्यूकोबकल गुना में 27 गेज सुई के साथ स्थानीय संज्ञाहरण इंजेक्ट करें। 25-50 डिग्री सेल्सियस पर्याप्त है। इंजेक्शन साइट के आसपास ऊतक की सूजन कल्पना की जानी चाहिए.

2. पल्प जोखिम

  1. एक 1 /4 दौर दंत बर्र, या एक ही आकार हीरा बर्र (एक लंबे टांग की सिफारिश की है) प्रति मिनट 800 राउंड (आरपीएम) की गति से का प्रयोग करें, किसी भी उपयुक्त दंत मोटर से जुड़ी (उदाहरण के लिए एक स्वचालित टोक़ में कमी (एटीआर) मोटर).
  2. पहले दाएँ मैंडिबुलर मोलर के अकोलेसाल भाग पर ड्रिल जब तक लुगदी सींग डेनटिन के माध्यम से दिखाई नहीं देते हैं। क्षेत्र से अधिक हीटिंग को रोकने के लिए मोटर के छोटे फटने का उपयोग करें।
  3. लुगदी को भेदने के लिए के-फ़ाइल या एच-फ़ाइल #8 या #10 का उपयोग करें और उन्हें कवर करने वाले डेनटिन को तोड़कर लुगदी सींग (मेसिअल और डिस्टल) में फ़ाइल डालें। फ़ाइलें ऑटोक्लेव द्वारा बाँझ कर रहे हैं.
  4. फ़ाइलों के साथ उद्घाटन को चौड़ा करते हुए, संभव के रूप में गहरी लुगदी के अंदर फ़ाइलों के साथ काम करना जारी रखें। आमतौर पर लुगदी से दिखाई देने वाला खून बह रहा होगा।
  5. प्रयोग के दौरान दर्द को कम करने के लिए बर्र के साथ दांत के तेज किनारों को गोल करने और occlusion से दांत को हटाने के लिए सुनिश्चित करें। एक माइक्रोब्रश के साथ प्रक्रिया के दौरान साफ मलबे।
  6. contralateral दांत (बाएं पहले mandibular मोलर) एक नियंत्रण के रूप में छोड़ दें.

3. नैदानिक प्रक्रिया का अंत

  1. निर्धारण स्थिति से माउस को छोड़ें और शरीर के वजन के प्रत्येक ग्राम के लिए Atipamezole IP (10 डिग्री सेल्सियस) इंजेक्ट करें। यह (4 मिलीग्राम/किग्रा) एटिपाज़ोल की अंतिम खुराक देगा।
  2. PBS/saline (0.05 mg/kg) आईपी में पतला buprenorphine इंजेक्शन (प्रक्रिया के दिन 3 एमएल की एक राशि तैयार करने के लिए अनुशंसित)। स्पष्टीकरण के लिए चर्चा देखें क्यों दर्द से राहत आवश्यक है.
  3. जानवरों उन्हें छोड़ने से पहले संज्ञाहरण से उबरने सुनिश्चित करें। उन्हें नरम खाना दें क्योंकि वे दांत दर्द के कारण कठिन भोजन खाने में असमर्थ हो सकते हैं।

4. पोस्ट प्रक्रिया अनुवर्ती (42 दिन)

  1. प्रक्रिया के बाद पहले 3 दिनों के लिए, जानवरों का वजन और Buprenorphine (0.1 mg/kg) आईपी एक दिन में एक बार इंजेक्ट (6mL की एक राशि तैयार करने के लिए सिफारिश की).
  2. प्रयोग के समय के दौरान (42 दिन जब सूजन बनाता है) वजन और सामान्य व्यवहार मूल्यांकन द्वारा जानवरों की निगरानी 2-3 बार एक सप्ताह.
  3. अनुवर्ती अवधि के दौरान जानवरों को नरम भोजन वितरित करें। पानी के साथ भोजन गीला और पिंजरे के फर्श पर एक पेट्री-डिश में डाल दिया।

5. प्रयोग समाप्ति और विश्लेषण

  1. जब 42 दिन अनुवर्ती के11 पूरा कर लिया गया है, 106.25 mg/kg Ketamine की एकाग्रता में ketamine/xylazine के साथ पशुओं आईपी anesthetize, और 75 mg/kg Xylazine (एक स्टॉक समाधान 42.5 mg/mL Ketamine, और 1.5 mg/mL Xylazine के साथ एक कुल मात्रा में 2L है की सिफारिश की) और पूर्व गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था.
    नोट: सूजन का मूल्यांकन करने के लिए संभव विश्लेषण के लिए विभिन्न विकल्प हैं20,21. यहाँ माइक्रो-सीटी और हिस्टोलॉजिकल धुंधला द्वारा ऊतक के विश्लेषण का वर्णन किया जाएगा।
  2. इच्छामृत्यु के बाद, 3 मोलर (प्रत्येक पक्ष के इलाज और गैर-उपचारित नियंत्रण के लिए अलग से) सहित जबड़े के हिस्से को काटने के लिए सर्जिकल कैंची और बलप्स का उपयोग करें। संदंश का उपयोग करके जितना संभव हो उतना नरम ऊतक छील, नमूने पर ज्यादातर हड्डी और दांत छोड़ने.
  3. पीबीएस में ऊतक को संक्षेप में कुल्ला करें, और फिर इसे पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) 4% (पीबीएस में पतला) में स्थिर करने के लिए 24-48 घंटे के लिए रखें।
    चेतावनी: एक रासायनिक हुड में पीएफए का उपयोग करें, और अपनी सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) दिशा निर्देशों के अनुसार.
  4. 24-48 घंटे के बाद, पीबीएस 3x के साथ कुल्ला क्रम में बाहर पीएफए धोने के लिए.
  5. माइक्रो-सीटी
    1. माइक्रो-सीटी विश्लेषण के लिए, काटा ऊतकों (3 मोलर सहित mandible का हिस्सा, लगभग 4 मिमी x 5 mmx 1 मिमी के आयामों में) एक माइक्रो-सीटी स्कैनर के लिए ले, उन्हें एक 12 मिमी व्यास ट्यूब में जगह पीबीएस उन्मुख के 1.5 एमएल से भरा इतना है कि मुख या lingual सतहों दांत और जड़ के ट्यूब के नीचे के समानांतर बिछाने रहे हैं. स्पंज के साथ नमूने के बीच अलग है, और लचीला फिल्म के साथ ट्यूब के शीर्ष को कवर.
    2. स्कैनिंग पैनल खोलें और माप संख्या चुनें. निम्नलिखित मापदंडों के साथ नियंत्रण फ़ाइल चुनें: 70 केवी की ऊर्जा, 114 डिग्री सेल्सियस की तीव्रता, और 6 डिग्री3 voxel आकार के संकल्प.
    3. स्काउट दृश्यपर क्लिक करें, और जब छवि प्रकट होती है, संदर्भ पंक्ति क्लिक करें और स्कैनिंग के लिए नमूनों के क्षेत्र को चिह्नित करें. प्रत्येक नमूना क्लिक करने के बाद स्कैनजोड़ें. जब नमूनों को चिह्नित किया जाए, तो कार्य सूची पर जाएँ और कार्य प्रारंभ करेंका चयन करें.
      नोट: एक ही नमूने बाद में ऊतक विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह महत्वपूर्ण है कि वे सीटी स्कैन के दौरान सूख न करें।
  6. माइक्रो-सीटी संरेखण और विश्लेषण के लिए किसी उपयुक्त कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग करें।
    1. माइक्रो-सीटी मूल्यांकन में XY विमान पर नमूना खोलें। संरेखण के लिए प्रत्येक नमूने पर तीन बिंदु चुनें:
      mesial शीर्ष संकुचन - निर्देशांक प्रणाली के मूल को परिभाषित करता है.
      मध्याहन नहर का कोरोनल भाग - अक्ष पर एक बिंदु को परिभाषित करता है।
      दूरस्थ शीर्ष संकुचन - एक्सजेड तल पर एक बिंदु को परिभाषित करता है।
    2. बाएँ फलक पर माप उपकरण का उपयोग करें, और प्रत्येक बिंदु तक पहुँचने के लिए एक रेखा आरेखित करें. यह सही पैनल में प्रकट होता है के रूप में एक एक्स, वाई और जेड मूल्य से तीन अंक में से प्रत्येक को परिभाषित करें।
    3. $CT मूल्यांकनके अंतर्गत कार्य का चयन करके नमूने में रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करें , और 3D मूल्यांकनपर क्लिक करें . एक आयत और अक्ष प्रति आयाम ों वाली एक विंडो स्क्रीन पर दिखाई देगी. माउस के मध्य बटन के साथ कोनों में क्लिक करके XY अक्ष पर ब्याज के क्षेत्र में फिट करने के लिए आयत के आयामों का मिलान करें। वीओआई प्रारंभके अंतर्गत $ वर्ग में ब्याज की पहली स्लाइस संख्या सम्मिलित करके , और डिमके अंतर्गत $ वर्ग में ब्याज की अंतिम स्लाइस संख्या तक पहले से स्लाइस की संख्या सम्मिलित करके , ] अक्ष में आयाम ों को चुनें।
    4. सत्र प्रबंधकके अंतर्गत अनुप्रयोगों पर क्लिक करें और DECtermचुनें. खोलने के लिए किसी विंडो के लिए कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें, और उसके बाद निम्न निर्देशों के अनुसार नीचे वर्णित slanted स्क्रिप्ट के पाँच चरण टाइप करें (पंक्तियों के बीच दर्जकरें क्लिक करें):
      आईपीएल
      इसक[टू]इम
      लक्ष्य1
    5. isk (हित की फ़ाइल) नाम की प्रतिलिपि बनाएँ: सत्र प्रबंधक के तहत दृश्यों का चयन करें और microCTdataक्लिक करें। फ़ाइल पर कार्य कर रहा ढूँढें, और फ़ाइल पर मध्य क्लिक करें. फिर मध्य वापस DECterm की खिड़की में क्लिक करें.
    6. ब्याज के क्षेत्र का चयन करते समय VOI के तहत निर्धारित किए गए थे जो एक्स, वाई और जेड मूल्यों (उन दोनों के बीच एक अंतरिक्ष के साथ) दर्ज करें।
    7. ब्याज के क्षेत्र का चयन करते समय मंद के तहत निर्धारित किए गए थे, जो एक्स, वाई और जेड मान दर्ज करें।
    8. एक संदेश प्राप्त करने तक प्रतीक्षा करें: पूरा लक्ष्य के लिए isQ.
      (कदम द्वितीय संरेखण):
      संरेखित z
      लक्ष्य1
      लक्ष्य2
    9. X, Y और $ मान दर्ज करें (उनके बीच एक रिक्ति के साथ) जो निर्देशांक प्रणाली के मूल के लिए निर्धारित किए गए थे.
    10. X, Y और $ मान दर्ज करें (उनके बीच एक रिक्ति के साथ) जो z अक्ष पर बिंदु के लिए निर्धारित किए गए थे.
    11. X, Y और $ मान दर्ज करें (उन दोनों के बीच एक स्थान के साथ) जो X$ विमान पर बिंदु के लिए निर्धारित किए गए थे.
    12. कोई संदेश प्राप्त होने तक प्रतीक्षा करें: "align] पूर्ण"
      (चरण III- शीर्षक):
      शीर्ष लेख
      लक्ष्य2
      0 0 0
      0 0 0
    13. दर्जकरें क्लिक करें.
      (चरण IV- फ़ाइल को वापस उद्देश्य से इस्कमें परिवर्तित करना ):
      टॉइस्क
      लक्ष्य2
    14. isk (हित की फ़ाइल) नाम की प्रतिलिपि बनाएँ: सत्र प्रबंधक के अंतर्गत दृश्य चुनें और microCT डेटाक्लिक करें. उस फ़ाइल को ढूँढें जिस पर आप कार्य कर रहे हैं, और फ़ाइल पर मध्य क्लिक करें. फिर मध्य वापस DECterm की खिड़की में क्लिक करें. मिटा ("बैकस्पेस" का उपयोग करके) ". ISQ" फ़ाइल के अंत में, और लिखें:"[new. ISQ" संरेखित फ़ाइल को पहचानने के लिए.
    15. दर्ज करें क्लिक करें ] दर्जकरें.
    16. एक संदेश प्राप्त होने तक प्रतीक्षा करें: "toisQ]from$aim पूरा किया"
      (कदम वी फ्लिप):
      इस्क
      ए
    17. नया isk (हित की फ़ाइल) नाम की प्रतिलिपि बनाएँ: सत्र प्रबंधक के अंतर्गत दृश्य चुनें और microCT डेटाक्लिक करें. फ़ाइल पर कार्य कर रहा ढूँढें, और फ़ाइल पर मध्य क्लिक करें. फिर मध्य वापस DECterm की खिड़की में क्लिक करें.
    18. दर्ज करें क्लिक करें ] दर्जकरें. एक संदेश प्राप्त करने के लिए प्रतीक्षा करें: "is$to$aim पूर्ण"
      फ्लिप
      ए
      Aa
      Zx
      एक संदेश प्राप्त करने के लिए प्रतीक्षा करें: "flip$aim पूरा"
      से
      Aa
    19. नया isQ नाम की प्रतिलिपि बनाएँ: सत्र प्रबंधक के अंतर्गत दृश्य चुनें और microCT डेटाक्लिक करें. फ़ाइल पर कार्य कर रहा ढूँढें, और फ़ाइल पर मध्य क्लिक करें. फिर मध्य वापस DECterm की खिड़की में क्लिक करें. मिटा ("बैकस्पेस" का उपयोग करके) ". ISQ" फ़ाइल के अंत में, और लिखें: "$flip. ISQ" संरेखित फ़ाइल को पहचानने के लिए.
    20. एक संदेश प्राप्त होने तक प्रतीक्षा करें: "from$aim]to-isQ पूर्ण"
  7. कंटूरिंग
    1. टुकड़ा है जो लगभग दांत के मध्य का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें कोरोनल लुगदी, दोनों नहरों के मूल लुगदी, और दोनों शीर्ष रंपति प्रस्तुत कर रहे हैं चुनें.
    2. मध्य स्लाइस पर ब्याज की समोच्च को मैन्युअल रूप से चिह्नित करें- ऊपरी बाएँ समोच्च पैनल पर क्लिक करके- दूरस्थ मूल शीर्ष के दूरस्थ बिंदु से शुरू होने वाले शीर्ष कोरोनली रेडियोपाक शीर्ष क्षेत्र के लिए शीर्ष सीमा चिह्नित करते हैं, मध्य मूल शीर्ष की मध्य सीमा के माध्यम से मध्य जड़ की दूरस्थ सीमा और फरेशन क्षेत्र के माध्यम से दूरस्थ जड़ की मध्य सीमा के बाद (चित्र 3 II,IV देखें)।
    3. इस समोच्च (Ctrl+C, Ctrl+V) की प्रतिलिपि बनाएँ और इसे तदनुसार मध्य स्लाइस के दोनों ओर स्थित 5 स्लाइस में समायोजित करें.
    4. प्रत्येक नमूना चयन कार्य के लिए चिह्नित समोच्च रेखा के ऊतक की मात्रा की गणना करने के लिए , और3 डी मूल्यांकनपर क्लिक करें . 3 डी मूल्यांकन की खिड़की में कार्य के पास का चयन करें क्लिक करें और ऊतक मात्रा (टीवी) की गणना करने के लिए एक फिल्टर का चयन करें।
  8. प्रोटोकॉल
    1. माइक्रो-सीटी स्कैनर से ऊतकों को हटाने के बाद, प्रत्येक नमूने को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 एमएल एथिलीनडायमाइनेटेरेसेटिक एसिड (EDTA) 0.5 एम एच 8.0 के साथ 10 दिनों के लिए डाल कर ऊतकों को निष्क्रिय कर दें। EDTA समाधान हर 3 दिन बदलें.
    2. निर्जलीकरण: हिस्टोलॉजिकल कैसेट में नमूने रखो, और इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने में, एक घंटे प्रत्येक, इस प्रकार है: 70% इथेनॉल (इस बिंदु पर प्रक्रिया कई हफ्तों के लिए रोका जा सकता है, जब तक नमूने इथेनॉल में रखा जाता है), 90% इथेनॉल 2x, 100% इथेनॉल 2x, xylene 2x (कौशन: एक रासायनिक हुड में xylene का उपयोग करें, और अपने MSDS दिशा निर्देशों के अनुसार).
      1. तरल पैराफिन (60 डिग्री सेल्सियस) के लिए कैसेट स्थानांतरण और xylene वाष्पित करने के लिए रात भर रासायनिक हुड में छोड़ दें।
    3. अवरुद्ध: पैराफिन में नमूने एम्बेड करने के लिए एक हिस्टोलॉजिकल ब्लॉकिंग मशीन का उपयोग करें। उन्हें एक सही स्थिति में एम्बेड करने के लिए सावधान रहें (यानी, मुकुट और जड़ों मोल्ड के नीचे के हिस्से के समानांतर उन्मुख होना चाहिए, एक तरह से है कि दांत "नीचे झूठ बोल रहा है") क्रम में sagittal वर्गों पाने के लिए. नमूने अब एक microtome के साथ कटौती करने के लिए तैयार हैं.
    4. वर्गों काटना: ऊतक के प्रासंगिक भाग तक पहुँचने तक $ 20 डिग्री मीटर की मोटी स्लाइस काटने से शुरू करो. एक बार दांत के किसी भी हिस्से को पहचानने (पागल या जड़ों) 6 डिग्री के वर्गों को बदलने के लिए, और पिछले अनुभाग के अनुसार काटने के कोण बदल जाते हैं।
      1. उदाहरण के लिए, यदि पिछले अनुभाग में मुकुट शामिल है, लेकिन जड़ों को नहीं, microtome में ब्लॉक के कोण को बदलने के लिए इतना है कि जड़ों चाकू के करीब आते हैं, और ताज वापस चला जाता है (दांत के कुछ हिस्सों ब्लॉक पर ही एक नग्न आँख से पहचाना जा सकता है).
      2. कोरोनल और रेडिक्युलर लुगदी, और शीर्ष रंकिल सहित sagittal वर्गों प्राप्त करने तक कोण को समायोजित करने के लिए जारी रखें। संभव के रूप में कई स्लाइस के रूप में इस अभिविन्यास में कटौती, जब तक प्रासंगिक ऊतक सब काट रहा है.
    5. धुंधला प्रोटोकॉल के लिए (उदाहरण के लिए, Haemotoxylin और Eosin धुंधला (एच एंड ई), ब्राउन और ब्रेन धुंधला, Tartrate-प्रतिरोधी एसिड Phosphatase (ट्रैप) धुंधला, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री), देखें20,21.

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Representative Results

प्रायोगिक चरणों का प्रवाह चार्ट चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल में उल्लेख के रूप में, चूहों anesthetized हैं, और एक तरफ उनकी पहली mandibular मोलर लुगदी जोखिम जब तक drilled है, जबकि contralateral दांत एक नियंत्रण के रूप में छोड़ दिया है. इसके बाद, दांतों को मौखिक वनस्पति यों द्वारा 42 दिनों के लिए दूषित होने के लिए छोड़ दिया जाता है, जिसके दौरान उनकी निगरानी की जाती है और दर्द की दवा प्राप्त होती है। 42 दिनों के बाद, चूहों ethanized हैं, और दांत और आसन्न जबड़े विश्लेषण के लिए लिया जाता है.

चित्रा 2 पहले सही मोलर लुगदी जोखिम के बाद माउस mandible के नैदानिक छवियों को दर्शाता है. चित्र 2क में संपूर्ण मंडलको दर्शाया गया है, जबकि चित्र 2ख में इनसेट में उपचारित प्रथम दाएँ मोलर की वृद्धि को दर्शाया गया है। बायां पहला मोलर एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। मध्य और दूरस्थ लुगदी सींगों तथा नहरों के प्रवेश द्वार दोनों का एक्सपोजर चित्र 2खमें देखा जा सकता है . ध्यान दें कि दर्द को कम करने के लिए दांत को यांत्रिक रूप से उप-कार्यकत्र्था के लिए उतारा गया था।

मौखिक वनस्पति के लिए दंत लुगदी जोखिम के बाद, दंत लुगदी अंततः दूषित है6,7 और नेक्रोटिक हो जाता है. साहित्य22के अनुसार, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया तो दांत के शीर्ष क्षेत्र के लिए lipopolysaccharide (LPS) स्रावित. प्रतिरक्षा प्रणाली की एक जटिल प्रतिक्रिया के माध्यम से, परिणामों में से एक पेरिएपिकल क्षेत्र में हड्डी अवशोषण है, जो शीर्ष periodontitis23की पहचान है। इस हड्डी अवशोषण की पहचान की जा सकती है और माइक्रो-सीटी द्वारा मात्रा निर्धारित की जा सकती है। माइक्रो-सीटी छवियों में, रेडियोलूसेंट पेरिएपिकल क्षेत्र उन क्षेत्रों को इंगित करते हैं जहां कठोर हड्डी ऊतक सूजन प्रक्रिया के कारण एक नरम पेरिएपिकल घाव बन गया था। चित्र 3में, प्रतिनिधि माइक्रो-सीटी छवियों एक नियंत्रण की तुलना में एक इलाज दांत प्रदर्शित करता है. मध्य लुगदी जोखिम पर चित्रा 3AIII अंक में तीर (जिला लुगदी जोखिम नमूना के इस टुकड़ा पर प्रकट नहीं होता है), और हड्डी अवशोषण के mesial और दूरस्थ periapical radiolucent क्षेत्रों एक डैश्ड लाइन से घिरे हुए हैं. यहाँ दिखाया गया एक बॉक्सप्लॉट ग्राफ नियंत्रण की तुलना में उपचारित दांतों में महत्वपूर्ण पेरिएपिकल हड्डी अवशोषण को परिमाणित करता है।

जबकि माइक्रो-सीटी घावों के 3-आयामी आकार के मूल्यांकन के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक है, यह उनकी जैविक संरचना के बारे में जानकारी की कमी है। चित्र 4में प्रस्तुत हिस्टोलॉजिकल अभिरंजन यह जानकारी प्रदान करता है। एच एंड ई धुंधला एक इलाज दांत की तुलना में एक नियंत्रण दांत में प्रदर्शन किया है. उपचारित दांत में (चित्र 4ठ, सी, डी), दंत लुगदी ही नेक्रोसिस प्रस्तुत करता है जिसे नियंत्रण संगठित लुगदी ऊतक की तुलना में एच एंड ई धुंधला (चित्र 4C) में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, और महत्वपूर्ण बात, इलाज दांत के पेरिएपिकल क्षेत्र में एक पेरिएपिकल घाव, प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बना (प्रमुख रूप से मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों), कल्पना की है (चित्रा 4 डी) (स्वस्थ periodontal स्नायुबंधन की तुलना में (PDL) और नियंत्रण दांत के पेरिएपिकल क्षेत्र में हड्डी ऊतक). यह परिक्षिणाल घाव प्रेरित शीर्ष periodontitis तकनीक यहाँ प्रस्तुत की वांछित परिणाम है.

दूसरी ओर, चित्र ाहा एक असफल संदूषण प्रस्तुत करता है जो दुर्लभ मामलों में घटित हो सकता है (कम से कम 85% पशु माइक्रो-सीटी में अस्थि अवशोषण दिखाते हैं), अर्थात, एक दांत जो 42 दिनों के लिए मौखिक वनस्पति के संपर्क में था, फिर भी लुगदी नेक्रोसिस प्रस्तुत नहीं किया और इसलिए माइक्रो-सीटी (चित्र 5क) और हिस्टोलॉजिकल (चित्र 5ख) विश्लेषण में अस्थि हानि और पेरिएपिकल घाव का प्रदर्शन नहीं किया ।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया का समय अक्ष. प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लौकिक प्रगति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सही पहले मोलर लुगदी जोखिम के बाद माउस mandible के नैदानिक छवियों. (ए) माउस mandible, उजागर लुगदी के साथ पहले सही दाएँ मोलर, पहले छोड़ दिया मोलर एक अनुपचारित नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. (बी) उजागर लुगदी के साथ सही मोलर का विस्तार। नहरों के प्रवेश द्वार की कल्पना की जा सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: माइक्रो-सीटी विश्लेषण। (A) उपचार (एआई, एआईवी) और नियंत्रण (एआई, एआईआई) दांतों के प्रतिनिधि माइक्रो-सीटी स्कैन (6 डिग्री मीटर के स्लाइस)। Mesial लुगदी जोखिम पर तीर अंक (जिला लुगदी जोखिम इस टुकड़ा में मौजूद नहीं है). उपचारित दांत से सटे अस्थि हानि के मध्य और दूरस्थ पेरिएपिकल क्षेत्र डैश्ड लाइनों से घिरे हुए हैं। AII, AIV- समोच्च अंकन के प्रतिनिधि छवियों. (ख) उपचारित (नीले, n]15 पशुओं) नमूनों की तुलना में नियंत्रण (नारंगी, n ]14 पशुओं) के प्रत्येक नमूने के 11 स्लाइस के लिए चिह्नित समोच्च द्वारा चिह्नित समोच्च मात्रा (बॉक्स-प्लाट मात्रा निर्धारित करना। यह विश्लेषण माइक्रो-सीटी के लिए स्कैनको मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। नमूने सैगिटल अक्ष पर इस तरह से संरेखित किए गए थे कि कोरोनल लुगदी, रूट कैनाल और शीर्ष रंकन को एक ही स्लाइस में कल्पना की गई थी (विस्तृत जानकारी के लिए प्रोटोकॉल देखें) अभिविन्यास के बारे में). Contours मध्य दांत क्षेत्र के दोनों ओर 5 स्लाइस के लिए चिह्नित किया गया (सभी एक साथ 11 स्लाइस). प्रत्येक नमूने की समोच्च के लिए ऊतक मात्रा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गणना की गई थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र ााला4: हिस्टोलॉजिकल एच एंड ई प्रतिनिधि चित्र: (क) एक नियंत्रण दांत का हिस्टोलॉजिकल टुकड़ा। (बी) एक इलाज दांत के हिस्टोलॉजिकल टुकड़ा, एक गंभीर पेरिएपमिक घाव के साथ प्रस्तुत किया. (सी) नेक्रोटिक ऊतक का विस्तार। (घ) पेरिएपिकल ग्रैनुलोमा ऊतक पीजेड लुगल्प, डीजेडडेनटिन, बीजेडबोन, बीएम-बोन मज्जा, पीडीएल-पीरियंटल लिगामेंट, एननेक्रोटिक लुगदी, जीजेड ग्रैनुलोमा की वृद्धि। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: असफल संदूषण का उदाहरण: (A) लुगदी जोखिम (सफेद तीर) के साथ एक दांत के माइक्रो-सीटी प्रतिनिधि छवि, लेकिन कोई महत्वपूर्ण periapical हड्डी हानि, से संबंधित(बी) हिस्टोलॉजिकल एच एंड ई उसी के प्रतिनिधि छवि दांत खुलासा महत्वपूर्ण (नहीं नेक्रोटिक) लुगदी, और सामान्य शीर्ष ऊतकों. पीजेड लुगदी, डीजेडडेंटिन, बीजेडबोन, बीएमजेडबोन मज्जा, पीडीएल-पीरियंटोंटल लिगामेंट। (ग ) बी में प्रस्तुत कैल्केतय ऊतक का विस्तार इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

चूहों में शीर्ष periodontitis के प्रेरण के लिए यहाँ एक विधि शुरू की है. विधि का लक्ष्य इस भड़काऊ प्रक्रिया के तंत्र और परिणामों का अध्ययन करने के लिए शीर्ष periodontitis स्थिति का दोहन करने के लिए है। एपिकल पीरियडॉनटिस 6-8 सप्ताह पुराने चूहों में प्रेरित किया गया था, एक उम्र जिसमें जड़ों को पूरी तरह से विकसित कर रहे हैं24. इस मॉडल में शीर्ष periodontitis पैदा करने के लिए, माउस mandibular मोलर के दांत लुगदी एक दंत बर्र का उपयोग कर उजागर किया जाता है. चूहों के मौखिक वनस्पति से बैक्टीरिया (एसपीएफ स्थितियों में) दांतों की लुगदी और रूट नहरों पर आक्रमण करते हैं, लुगदी परिगलन के कारण, और शीर्ष ऊतकों को एलपीएस स्रावित करते हैं, जो शीर्ष सूजन को ट्रिगर करता है।

इस प्रक्रिया को पूरा करते समय, निम्नलिखित महत्वपूर्ण चरणों पर ध्यान दें। लुगदी जोखिम के दौरान जानवरों की सही स्थिति प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. एक महत्वपूर्ण कदम लुगदी के उचित जोखिम है. अपर्याप्त नहर जोखिम एक Dentin पुल गठन में परिणाम कर सकते हैं, जो प्रक्रिया की विफलता और एपी बनाने में असमर्थता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. लुगदी जोखिम के दौरान, ध्यान अन्य क्षेत्रों में अवांछित दर्द और सूजन जो साइड इफेक्ट का कारण बन सकता है से बचने के लिए लुगदी जोखिम के दौरान नरम ऊतक चोट को कम करने के लिए आवश्यक है। माइक्रो-सीटी विश्लेषण सॉफ्टवेयर में नमूनों की उचित संरेखण व्याख्या योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। ऊतक विज्ञान के लिए जबड़े के ऊतकों की तैयारी करते समय, ऊतक विज्ञान के लिए मोल्ड तैयार करते समय सही अभिविन्यास प्राप्त करने के लिए हड्डी के आसपास के कोमल ऊतक को छील करने की सिफारिश की जाती है। नमूने पूरी प्रक्रिया के दौरान गीला माध्यम में रखा जाना चाहिए (संग्रहण चरण से, माइक्रो-सीटी के माध्यम से, हिस्टोलॉजिकल ब्लॉक प्रक्रिया तक)। जब एक microtome में ऊतक काटने, नमूना के कोण के क्रम में दांत की sagittal स्लाइस को प्राप्त करने के लिए तय किया जाना चाहिए. पशुओं के कल्याण से संबंधित नैतिक मुद्दों को भी ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, प्रक्रिया के दौरान उचित संज्ञाहरण महत्वपूर्ण है (दोनों प्रणालीगत और स्थानीय,देखें 25,26)। दर्द की दवा आवश्यक है, विशेष रूप से प्रक्रिया के बाद पहले कुछ दिनों के लिए, और वजन और व्यवहार की निगरानी के साथ ही नरम भोजन के साथ जानवरों की आपूर्ति लागू किया जाना चाहिए. पिछले अनुभव से, चूहों की समग्र प्रतिक्रिया अच्छी तरह से प्रक्रिया को सहन करने के लिए है और वे चरम संकट का प्रदर्शन नहीं है.

विधि की विफलता मामलों में माना जाता है जहां एक शीर्ष सूजन के रूप में विफल: माइक्रो-सीटी स्कैन पर दांत के पेरिएप्कल क्षेत्र में हड्डी अवशोषण के लिए कोई सबूत नहीं है, और दांत के पीडीएल ऊतक हिस्टोलॉजिकल दाग में बरकरार है (जैसा चित्र 5में प्रस्तुत किया गया है। सूजन को प्राप्त नहीं करने के लिए संभावित कारणों में जानवरों के व्यवहार में स्टोचैस्टिक मतभेद शामिल हैं और साथ ही बैक्टीरिया के लिए प्रत्येक जानवर के विशिष्ट जोखिम शामिल हैं। हालांकि इस विधि का उपयोग करके शीर्ष periodontitis के कारण में अच्छे परिणाम प्राप्त कर रहे हैं (कम से कम 85% जानवरों की हड्डी अवशोषण दिखाने), प्रोटोकॉल बारीकी से नमूने के बीच किसी भी भिन्नता को कम करने के लिए का पालन करें. यदि कोई चूहे अनुवर्ती अवधि के दौरान संकट के लक्षण दिखाते हैं, तो दुख को रोकने के लिए उन्हें प्रयोग से हटाने पर विचार करें। ऐसा करने का निर्णय अनुवर्ती अवधि के दौरान पशुओं के वजन में कमी या लाभ को देखकर सहायता प्राप्त हो सकती है। पशु है कि वजन का एक बहुत खो पीड़ित हैं और हटाया जाना चाहिए. हमने यह भी देखा है कि सबसे अधिक पीड़ित जानवर वे हैं जिन्होंने कम वजन या खराब स्वास्थ्य स्थिति पर प्रयोग शुरू किया था। कुल मिलाकर, प्रक्रिया, अगर सही ढंग से किया, लगातार परिणाम उपज चाहिए.

इस तकनीक की कई सीमाओं पर ध्यान दिया जाना है. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह मॉडल जीवाणु संदूषण के कारण शीर्ष periodontitis का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था और कई अन्य संभव तंत्र ों की नकल नहीं करता है जिसके द्वारा शीर्ष periodontitis उत्पन्न हो सकता है, जैसे दर्दनाक चोट और स्वत: भड़काऊ रोग। इसके अलावा, इस मॉडल और मानव रोगियों में नैदानिक स्थिति के बीच महत्वपूर्ण मतभेद मौजूद हैं. चूहों में, सहज periapical घावों का वर्णन नहीं किया गया है और यह पूरी तरह से एक कृत्रिम स्थिति है. कृंतक दांतों की शरीर रचना भी मनुष्यों से भिन्न होती है; इन मतभेदों के महत्व अज्ञात जा रहा है. फिर भी, माउस बुनियादी तंत्र और घटना को समझने के लिए एक अत्यंत उपयोगी मॉडल है. इसके अलावा, एक माउस में एक रूट कैनाल चिकित्सा मॉडल (एक रूट नहर के साथ इलाज करके) अब तक रिपोर्ट नहीं किया गया है, लेकिन संभावित अनुसंधान के इस क्षेत्र में उच्च महत्व है यह संभव साबित होना चाहिए. चूहों के लिए लुगदी कैपिंग की एक विधि की सूचना दी गई है, जो महान क्षमता27को दर्शाती है। एक रूट कैनाल चिकित्सा मॉडल वास्तव में हाल ही में चूहों में विकसित किया गया है, एक मॉडल जानवर अक्सर endodontic अनुसंधान28में इस्तेमाल किया . विधि यहाँ रिपोर्ट इस रूट नहर चिकित्सा मॉडल के विकास के लिए एक प्रारंभिक प्रक्रिया के रूप में सेवा कर सकता है.

एक में एक vivo विधि का उपयोग इस तरह के एक जटिल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, और एक माउस मॉडल, हालांकि चिकित्सकीय पशु के छोटे आकार के कारण चुनौतीपूर्ण, कई फायदे हैं: यह लागत प्रभावी है, आसानी से सुलभ सुविधाओं शामिल है, और का एक सेट उपलब्ध आनुवंशिक और आणविक उपकरण (जैसे उपलब्ध नॉक-आउट, CRISPR पुस्तकालयों और जीनोमिक डेटा की एक भीड़ के रूप में). इस मॉडल endodontic अनुसंधान के लिए सबसे उपयुक्त है, के रूप में यह बाँझ प्रयोगशाला की स्थिति में एपी के नैदानिक प्रस्तुति लाती है, कम से कम विविधताओं के साथ (के रूप में नैदानिक अध्ययन के लिए विरोध). इसके अलावा, इस मॉडल को भी अन्य अनुसंधान क्षेत्रों में लाभ है, इस तरह के पुराने सूजन के रूप में, कम से कम प्रणालीगत भागीदारी के साथ एक पुरानी लेकिन स्थानीय सूजन पैदा करने की क्षमता के कारण, और एक नियंत्रण के रूप में एक ही जानवर के contralateral पक्ष का उपयोग.

यह काम घाव के विश्लेषण के लिए माइक्रो-सीटी और ऊतक विज्ञान के उपयोग की रिपोर्ट करता है। संभावित रूप से, इस मॉडल में अन्य प्रकार के विश्लेषण का उपयोग किया जा सकता है जो यहां प्रदर्शन नहीं किया गया था, जैसे कि सूजन कोशिकाओं में विभिन्न जीनों पर डीएनए और डीएनए मिथाइल का परीक्षण करना; अलग-अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं या चूहों के विभिन्न प्रकार में जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न को देखने के लिए आरएनए और प्रदर्शन आरएनए-सेक; या अलग - अलग कोशिकाओं और उन्हें FACS20,21,29द्वारा विशेषता . सामूहिक रूप से, वहाँ मॉडल में एक महान क्षमता यहाँ की सूचना दी है, जो उम्मीद है कि इस रिपोर्ट प्रोटोकॉल और प्रदर्शन द्वारा सुविधा होगी.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

हम पशु स्थिति के साथ उसकी मदद के लिए डॉ Oded Heyman स्वीकार करना चाहते हैं, माइक्रो सीटी विश्लेषण के साथ मदद के लिए Raphael Lieber, और प्रो Andiara डी रॉसी Daldegan प्रयोग preforming पर सलाह के लिए. हम यह भी महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए डॉ सिडनी कोहेन स्वीकार करना चाहते हैं.

इस काम के लिए डॉ Izador I. Cabakoff अनुसंधान एंडोमेंट फंड से एमके और आईए के लिए एक अनुदान, और विज्ञान और प्रौद्योगिकी के इसराइल मंत्रालय से ईजी के लिए एक Yitzak Navon फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Eurovet Animal Health CAS 104075-48-1
ATR dentsply tecnika
blocking machine Leica EG1150H
buprenorphine vetmarket 163451
clinical microscope/binocular Olympus Sz61
dental bur Komet dental ZR8801L 315 008
dental spatula Premier 1003737
EDTA J.T Baker 8993
entelan mercury 1.07961
Eosin Y solution, alcoholic SIGMA HT110116
hematoxylin solution, Mayer's SIGMA MHS 16
Ketamine hydrochloride Vetoquinol CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor) CP-pharma GmbH CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3% Teva CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators PARKELL S379
micro-ct scanner scanco uCT 40
parafin Leica 39602004
PBS SIGMA D8537
PFA EMS 15710
Chloramphenicol eye ointment (5%) Rekah pharmaceutical CAS 56-75-7
tweezers WAM Ref-CT
xylazine Eurovet Animal Health CAS 7361-61-7
xylene Gadot CAS 1330-20-7

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References

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Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M. Inducing Apical Periodontitis in Mice. J. Vis. Exp. (150), e59521, doi:10.3791/59521 (2019).

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