יישום של מיקרוסקופ לא לינארית על בסיס פיזור ראמאן מגורה
Summary
בכתב יד זה, היישום של מיקרוסקופ ראמאן מגורה (SRS), המתקבל על ידי שילוב של הגדרת הניסוי SRS הערכה עם מיקרוסקופ סריקת לייזר, מתואר. מיקרוסקופ SRS מבוסס על שני מקורות לייזר (שניים), טי-ספיר (Ti: Sa) ומתנד פרמטרי אופטי מסונכרן (פופו).
Abstract
מיקרוסקופית פיזור ראמאן (SRS) משתמש באור עירור הקרוב לאינפרא-אדום; לפיכך, היא חולקת הרבה תכונות הדמיה רב-פוטון מיקרוסקופיים. מודאליות של הדמיה SRS ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ מסחרי סריקת לייזר על ידי הציוד עם גלאי הקדמי לא מסורק עם מסננים הנכון bandpass ו נעל-in מגבר (LIA) זיהוי תוכנית. פריסה סכמטית של מיקרוסקופ SRS אופייני כולל את הפרטים הבאים: שני קרני לייזר פעמו, (כלומר, המשאבה והבדיקה מכוונת במיקרוסקופ סריקה), אשר חייב להיות חופפים בחלל ובזמן במישור התמונה, ואז ממוקד על ידי מטרה מיקרוסקופ לתוך המדגם דרך שתי מראות סריקה (SMs), אשר רסטר את הנקודה המוקד על פני מטוס x-y. לאחר האינטראקציה עם המדגם, פולסים פלט ששודרו נאספים על ידי המטרה העליונה נמדדת על ידי מערכת זיהוי קדימה שנוספה במיקרוסקופ הפוך. פולסים משאבה מוסרים על ידי ערימה של מסננים אופטיים, ואילו פולסים בדיקה כי הם תוצאה של תהליך SRS המתרחשים נפח המוקד של הדגימה נמדדת על ידי פוטודיודה (PD). הבדיקה של המשטרה היא מאוד מדולמת על ידי ה-LIA כדי לחלץ את עומק האפנון. תמונה דו-ממדית (דו-ממדית) מתקבלת על ידי סנכרון יחידת הזיהוי הקדמי עם יחידת סריקת המיקרוסקופ. במאמר זה, היישום של מיקרוסקופ SRS מתואר והפגינו בהצלחה, כמו גם את הדיווח של תמונות ללא תווית של חרוזי פוליסטירן עם קטרים של 3 μm. ראוי לציין כי מיקרוסקופים SRS אינם זמינים מסחרית, כך על מנת לנצל את המאפיינים הללו, הבנייה ביתית היא האפשרות היחידה. מאז מיקרוסקופ SRS הופך פופולרי בתחומים רבים, הוא האמין כי תיאור זה זהיר של יישום מיקרוסקופ SRS יכול להיות מאוד שימושי עבור הקהילה המדעית.
Introduction
ביישומי מדעי החיים, מיקרוסקופ SRS התפתחה ככלי רב עוצמה עבור דימות ללא תווית. הרעיון הבסיסי של מיקרוסקופ SRS הוא לשלב את עוצמת הניגודיות התנובותית ואת יכולתה להשיג תמונות בתוך שניות ספורות.
SRS הוא תהליך שבו הפרש התדירות בין שני תדרי קרני לייזר (אות משאבה ואות סטוקס בתדרים שונים) מתאים את הרטט המולקולרי של דגימת נחקר, וגורם מגורה פיזור ראמאן ומשמעותי עליה. באות של סטוקס בניגוד ליניארי ספקטרוסקופית ראמאן, SRS מציג תלות לא לינארית על שדות האור הנכנסות ומייצרת קרינה קוהרנטית. ל-SRS יש שני יתרונות בסיסיים: 1) מהירות, מה שהופך את התמונות לרגישות פחות לחפצי אמנות הנובעים מתנועה לדוגמה או השפלה, ו-2) יחס מעולה של אות לרעש (SNR). בנוסף, srs מציג ספקטרום זהה ראמאן ספונטנית, ואת האות SRS הוא פרופורציונלי ליניארי לריכוז של הקשר הכימי נרגש1,2,3,4, 5. המשך
במיקרוסקופ שלנו, הגדרת שנייה (fs) SRS ניסיוני משולב עם מיקרוסקופ אופטי הפוך מצויד מראות מהירה יחידת סריקה (איור 1)6,7,8. שני מקורות לייזר פעמו משמשים ליישום מיקרוסקופ זה. הראשון הוא fs-Ti: Sa עם משך פעימה של כ 140 fs, קצב חזרה של 80 MHz, ואורכי גל פליטה בטווח של 680-1080 nm. השני, המשמש כקרן בדיקה ושאוב על ידי Ti: Sa, היא מתנד פרמטרית מסונכרן האופטי השני (SOPO), עם משך הדופק של כ 200 fs, שיעור חזרה של 80 MHz, ואורכי גל פליטה בטווח של 1000-1600 nm. יצוין כי ההבדל אנרגיית פוטון המינימלי בין Ti: Sa ו-SOPO קורה הוא 2500 ס”מ-1. לכן, באמצעות שילוב זה של מערכות לייזר, רק בתדירות גבוהה C-H אזור (2800-3200 ס”מ-1) של ראמאן ספקטרום ניתן לחקור6,7,8.
כדי להקים מיקרוסקופ SRS יש שלושה נושאים קריטיים לשקול, המתוארים בפסקאות העוקבות. הראשון הוא יישום של שיטת העברת אפנון בתדר גבוה (ראה איור 2 וצעד 2.1 של הפרוטוקול לתיאור). בחקירה ניסויית של SRS, פרמטר חיוני הוא רגישות המערכת. אות SRS מזוהה כשינוי קטן בעוצמת קורות העירור; לכן, זה יכול להיות פגום על ידי רעש לייזר בעוצמה ורעש ירה. ניתן להתגבר על בעיה זו על-ידי שילוב מערכת זו עם שיטת העברת אפנון בתדר גבוה (ראה איור 2 וצעד 2.1 של הפרוטוקול לקבלת פרטים). בשיטה זו, מאופנן אלקטרו-אופטיים (EOM) משמש לווסת את המשאבה. אפנון הועבר קרן בדיקה לאחר מכן ניתן לזהות על ידי משטרת לאחר חסימת קרן המשאבה עם ערימה של מסננים אופטיים [גירוי לצבור ראמאן (SRG) מצב זיהוי]. פלט ה-PD מחובר באמצעות מסנן מעבר נמוך למגבר מנעול (LIA), אשר מדגיש את האות הנמדד. על-ידי הגברת תדירות האפנון של הקרן לתדרים מעל 1 MHz, ניתן להשיג את המגבלה הפנימית של PDs.
הסוגיה השנייה לשקול הוא התקנה של הר מכני אשר מאפשר לבצע זיהוי קדימה באותו זמן כדי לשמר את ההתבוננות במיקרוסקופ ברייטפילד. בנוסף, הוא צריך להפחית את הרעש עקב רטט מכני במהלך הדור של תמונות ולאפשר מיקום מדויק של מערכת האיתור (ראה איור 3 וצעד 2.2 של הפרוטוקול).
השלישי הוא סנכרון האות שנרכש על ידי ערכת האיתור התלויית-פאזה, כאשר הקרן ממוקמת על המדגם הנמצא במעקב על-ידי ראש הסורק של המיקרוסקופ. כדי להגשים תמונות, ה-SMs דורש שלושה אותות TTL שנעשים זמינים על-ידי בקר המיקרוסקופ המחובר ליחידת ראש הסריקה: שעון פיקסל, סנכרון קו, וסנכרון מסגרת. הסנכרון מושג על ידי שליטה באמצעות כרטיס PCI, שלושת אותות הTTL, ורכישת אות מתח בערוץ הפלט של LIA6,7,8. תוכנה תוצרת בית פותחה ותוארה בעבר6,7,8, בעוד החומרה של מערכת הסינכרון מדווחת באיור 4.
הליך בסיסי בעת ביצוע הדמיה SRS הוא יישור מיקרוסקופ. היא ממומשת במהלך ארבעת השלבים, המתוארים בפסקאות העוקבות. הראשון הוא חפיפה מרחבית של שתי קורות (ראה שלב 3.1 של הפרוטוקול). בערכה ניסיונית זו, שתי הקורות היו משולבים באופן קוליניארי בשילוב על ידי מראה דיקרואיק. הצעד הראשוני הוא היישור של פופו ו-Ti: Sa כך שכל אחד מהם מגיע למיקרוסקופ. אז, בהתחשב ב-פופו כקרן התייחסות וניצול של גלאי מיקום רגיש, Ti: Sa הוא חופף באופן מהותי ל-פופו.
ההיבט המכריע השני הוא החפיפה הטמפורלית של שתי קורות (ראה שלב 3.2 של הפרוטוקול). גם אם המשאבה ו-פופו קורות מסונכרנים באופן מושלם9, מאז הם בעקבות שבילים מעט שונים הקורה בתוך הדיור פופו, ביציאה פופו יש להם עיכוב זמן של כ 5 ns והבדל מרחבי של 5 ס מ. לכן, Ti: Sa ו-פופו דורשות לבצע מחדש את הזמן הקצוב באופן מתוזמן כדי להבטיח חפיפה זמנית במדגם. הדבר מתבצע בדרך כלל עם קו השהיה אופטי הניתן לפעולה דק, אשר במקרה זה מוכנס בין Ti: Sa ומיקרוסקופ (ראה איור 1). על מנת להשיג חפיפה זמנית של שתי קורות, נעשה שימוש בשתי טכניקות. הראשונה מבוצעת באמצעות משטרת מהירה והאוסילוסקופ, בעוד השני מבוסס על מערכת יחסים אוטומטית ומחוצה אופטי. באמצעות הטכניקה הראשונה, חפיפה מחוספס של שתי קורות מושגת (אי ודאות של 10 ps), בעוד החפיפה הזמני מדויק של שתי קורות מושגת באמצעות משתמש חוצה (רזולוציה של 1 fs).
ההיבט העיקרי השלישי הוא יישור של שתי הקורות בתוך המיקרוסקופ (ראה שלב 3.3 של הפרוטוקול). התבוננות מוקדמת באור לבן של המדגם מאפשרת לאינדיבידוקה את השדה הרצוי (FOV). לאחר מכן, קרני לייזר, כניסה למיקרוסקופ על ידי נמל צדדי של מיקרוסקופ, מיושרים על מנת להגיע למשטרה רכוב על החלק העליון (איור 3). עם זאת, עבור רכישת תמונה נכונה, הגדרת מספר פרמטרים נדרש (לדוגמה, מימד פיקסל ופיקסל זמן לשכון). תדר הדגימה חייב לכבד את האילוץ שהוטל על ידי משפט נייקוויסט על מנת לשמר את כל המידע בתמונה, ובמקביל לתכתובת נכונה בין הקואורדינטות המרחבית של פיקסלים לבין ערך SRS הנמדד בכל פיקסל, זמן האינטגרציה של LIA צריכה להיות שווה או דומה לזמן לשכון פיקסל.
בשלב האחרון של יישור מיקרוסקופ, בדיקות רבות מתבצעות כדי לייעל את היישור המרחבי והזמני (ראה שלב 3.4 של הפרוטוקול). מספר תמונות שידור (TI) עבור שתיהן Ti: Sa ו-פופו נרכשים כדי לייעל את החפיפה המרחבית. ב-TI, נעשה שימוש בקרן בודדת, ועוצמת הקרן המועברת מהמדגם נמדדת על-ידי משטרה. במקרה של TI הבינה על-ידי פופו, אות הפלט של PD מחובר ישירות לכרטיס PCI, ואילו במקרה של TI הבינה על-ידי Ti: Sa, אות הפלט של PD מחובר ל-LIA ופלט אנלוגי של LIA מחובר לכרטיס PCI. תמונות השידור שימושיות מאוד כדי למטב את fov, את התאורה, את המיקום המוקד של מטרות מיקרוסקופ וכדי לבדוק אם שתי הקורות הם בעלי שליטת חופפים6,7,8.
אופטימיזציה של המשאבה ובדיקת חפיפה הזמני של קרן מושגת על ידי סריקת קו ההשהיה עם שלבים של 0.001 מ”מ המתאימים 3.3 fs זמן משמרת וביצוע מדידה SRS בנקודה אחת של מדגם חרוז בפוליסטירן 3 יקרומטר קוטר. השרעת של אות SRS מודדת ערכים מליה, כפונקציה של עיכוב בדיקת המשאבה, והיא מספקת המקבילה המדויקת לחפיפה בזמן המדויק של שתי הקורות6,7,8. לפני הסיכום, יש לציין כי כל הצעדים הנדונים הם חובה כדי לקבל תמונה באיכות גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרוסקופ SRS לקח הדמיה ללא תווית לגבהים חדשים, במיוחד במחקרים של מבנים ביולוגיים מורכבים כגון שומנים, שהם בסיסיים לתאים ולארכיטקטורה סלולרית. שומנים מעורבים במסלולים פיזיולוגיים מרובים כגון ייצור של ממברנות ביולוגיים, והם משמשים כלסמנים biosynthetic ו מתמרים אותות10. שומנים הם ארו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים V. Tufano מ IMM CNR עבור סיוע טכני יקר שלו ג’אקומו Cozzi, מומחה מוצר ממכשירים ניקון, עבור דיונים שימושיים תמיכה רציפה. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי האיטלקי הלאומי תוכניות PONa3 00025 (BIOforIU) ועל ידי היורו-Bioדימות פרויקט בקנה מידה גדול של תשתית מחקר panEuropean.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D’Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
