刺激されたラマン散乱に基づく非線形顕微鏡の実施
Summary
本原稿では、レーザー走査顕微鏡とのSRS実験セットアップの統合により得られる刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡の実装について説明する。SRS顕微鏡は2つのフェムト秒(fs)レーザー源、Ti-Sapphire(Ti:Sa)および同期光学パラメトリック発振器(OPO)に基づいている。
Abstract
刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡は近赤外線励起光を使用する;したがって、それは多くのマルチフォトン顕微鏡イメージング特性を共有しています。SRSイメージングモダリティは、適切なバンドパスフィルタとロックインアンプ(LIA)検出スキームを備えた非スキャンフォワードディテクタを装備することにより、市販のレーザー走査顕微鏡を使用して得ることができます。典型的なSRS顕微鏡の概略レイアウトには、2つのパルスレーザービーム(すなわち、走査顕微鏡で向けられたポンプとプローブ)が含まれており、これは画像面の空間と時間の両方で重なり合う必要があり、その後、顕微鏡の目的によって焦点を合わせます。サンプルは、X-y 平面を横切る焦点をラスターする 2 つのスキャン ミラー (SM) を介して行います。サンプルとの相互作用の後、送信された出力パルスは上の目的によって集められ、反転された顕微鏡に挿入される前方検出システムによって測定される。ポンプパルスは光学フィルターの積み重ねによって除去され、一方、試料の焦点体積で起こるSRSプロセスの結果であるプローブパルスはフォトダイオード(PD)によって測定される。PD の読み出しは、変調深度を抽出するために LIA によって復調されます。前方検出部を顕微鏡走査ユニットと同期させることにより、2次元(2D)画像を得ることができます。本論文では、SRS顕微鏡の実装について説明し、実証に成功し、直径3μmのポリスチレンビーズのラベルフリー画像の報告に成功した。SRS顕微鏡は市販されていないので、これらの特性を利用するために、自家製の構造が唯一の選択肢です。SRS顕微鏡検査は多くの分野で普及しつつあるため、SRS顕微鏡の実装に関するこの注意深い記述は、科学界にとって非常に有用であると考えられています。
Introduction
ライフサイエンスアプリケーションでは、SRS顕微鏡検査はラベルフリーイメージングのための強力なツールとして登場しました。SRS顕微鏡検査の基本的な考え方は、振動コントラストの強さと数秒で画像を取得する能力を組み合わせることです。
SRSは、2つのレーザービーム周波数(ポンプ信号とストーク信号が異なる周波数で信号をストーク)と一致し、ラマン散乱を刺激し、有意な結果を引き起こすプロセスです。ストークス信号の増加。線形ラマン分光法とは異なり、SRSは入射光場に非線形依存性を示し、一貫した放射線を生成します。SRSには、1)速度、サンプルの動きや劣化に起因するアーティファクトに対する画像の感度が低くなる、2)優れた信号対雑音比(SNR)の2つの基本的な利点があります。さらに、SRSは自発的なラマンと同一のスペクトルを示し、SRS信号は、励起1、2、3、4、化学結合の濃度に直線的に比例する。5.
私たちの顕微鏡では、フェムト秒(fs)SRS実験セットアップは、高速ミラースキャンユニット(図1)6、7、8を装備した反転光学顕微鏡と統合されています。この顕微鏡を実装するために2つのパルスレーザー源が使用されます。1つ目は、パルス持続時間が約140fs、繰り返し速度が80MHz、発光波長が680~1080nmのfs-Ti:Saです。第2は、プローブビームとして使用され、Ti:Saによってポンピングされたフェムト秒同期光学パラメトリック発振器(SOPO)で、パルス持続時間は約200fs、繰り返し速度は80MHz、発光波長は1000~1600nmです。なお、Ti:SaとSOPOビームの間の最小光子エネルギー差は2500cm-1である。従って、このレーザーシステムの組み合わせを用いて、ラマンスペクトルの高周波C-H領域(2800-3200cm-1)のみを探索することができる6、7、8。
SRS顕微鏡をセットアップするためには、連続する段落に記載されている3つの重要な問題を考慮する必要があります。1 つ目は、高周波変調転送方式の実装です (説明については、プロトコルの図 2およびステップ 2.1 を参照)。SRSの実験的調査では、重要なパラメータはシステムの感度です。SRS信号は励起ビームの強度の小さな変化として検出されます。したがって、レーザー強度ノイズやショットノイズによって破損する可能性があります。この問題は、このシステムを高周波変調転送方式と統合することで解決できます (詳細については、プロトコルの図 2およびステップ 2.1 を参照してください)。この方法では、ポンプを調節するために電気光学変調器(EOM)が使用されます。プローブビームに転送された変調は、光学フィルタのスタックでポンプビームを遮断した後にPDによって検出することができる[刺激されたラマンゲイン(SRG)検出モード]。PD出力はローパスフィルタでロックインアンプ(LIA)に接続され、測定された信号を復調します。ビームの変調周波数を1MHz以上の周波数に増やすことで、PDの本質的な限界を得ることができます。
考慮すべき第二の問題は、前方検出を行うことを可能にする機械マウントの設置と同時に、明るい分野での顕微鏡観察を維持することです。さらに、画像の生成時に機械的振動による騒音を低減し、検出システムの正確な再配置を可能にする必要があります(プロトコルの図3およびステップ2.2を参照)。
第3は、位相感受性検出スキームによって得られた信号の同期であり、ビームは顕微鏡のスキャンヘッドによって監視されるサンプルに置かれる。画像を実現するためには、スキャンヘッドユニットに接続された顕微鏡コントローラが利用できる3つのTTL信号(ピクセルクロック、ライン同期、フレーム同期)が必要です。同期は、PCIカード、3つのTTL信号、およびLIA6、7、8の出力チャネルでの電圧信号の取得を使用して制御することによって達成される。自家製ソフトウェアが開発され、前述の6,7,8, 同期システムのハードウェアが図4で報告されています。
SRSイメージングを行う際の基本的な手順は、顕微鏡アライメントです。これは、連続する段落に記載されている4つのステップの過程で実現されます。1 つ目は、2 つの梁の空間的な重なりです(プロトコルの手順 3.1 を参照)。この実験セットアップでは、2つのビームをダイクロイックミラーによって空間的に結合した。予備ステップは、それぞれが顕微鏡に到達できるように、OPOとTi:Saの位置合わせです。次に、OPOを基準ビームとして考え、位置感度検出器を利用して、Ti:Saを空間的にOPOと重なります。
2 番目の重要な側面は、2 つのビームの時間的な重なりです (プロトコルの手順 3.2 を参照)。ポンプとOPOビームが完全に同期している場合でも9、OPOハウジング内のわずかに異なるビームパスに従うため、OPO出口では約5nsの時間遅延と5cmの空間差があります。したがって、Ti:Sa と OPO は、サンプルで時間的な重複を確実にするために、光学的に再タイミングを行う必要があります。これは通常、Ti:Saと顕微鏡の間に挿入される微細に微調整可能な光遅延ラインで達成されます(図1参照)。2 つのビームの時間的な重なりを得るために、2 つの手法が使用されます。1つ目は高速PDとオシロスコープを使用して行い、2つ目は自動およびクロスオプティカル相関に基づいています。最初の技術を使用して、2つのビームの大まかな重なり(10psの不確実性)、2つのビームの正確な時間的な重なりはクロスコリレータ(1 fsの分解能)を使用して得られます。
第3の重要な側面は、顕微鏡内の2つのビームの位置合わせです(プロトコルのステップ3.3を参照)。サンプルの予備的な白色光観察は、所望の視野(FOV)を分割することを可能にする。その後、レーザー光は、顕微鏡の側面ポートによって顕微鏡に入り、上部に取り付けられたPDに到達するために整列される(図3)。ただし、正しい画像集録を行うには、いくつかのパラメータ(ピクセル寸法やピクセルの所要時間など)を設定する必要があります。サンプリング周波数は、画像内のすべての情報を保持するためにナイキストの合理士によって課される制約を尊重する必要がありますが、各ピクセルで測定されたピクセルの空間座標とSRS値の間の正しい対応のために、統合時間LIA は、ピクセルのドウェル時間と等しいか同等である必要があります。
顕微鏡アライメントの最終段階では、空間的および時間的な位置合わせを最適化するために多数の試験が行われます(プロトコルのステップ3.4を参照)。空間的な重なりを最適化するために、Ti:Sa と OPO の両方に対して多数の伝送イメージ (TI) が取得されます。TIでは、単一のビームが使用され、サンプルからの透過ビーム強度がPDによって測定されます。OPOで実現したTIの場合、PD出力信号はPCIカードに直接接続され、Ti:Saで実現したTIの場合は、PD出力信号がLIAに接続され、LIAのアナログ出力がPCIカードに接続されます。透過画像は、FOV、照明、顕微鏡目的の焦点位置を最適化し、2つのビームが空間的に重なっているかどうかを確認するのに非常に有用である6、7、8。
ポンプとプローブビームの時間的な重なりの最適化は、3.3fsのタイムシフトに対応する0.001mmのステップで遅延ラインをスキャンし、直径3μmのポリスチレンビーズサンプルの単一点でSRS測定を行うことによって得られます。SRS信号の振幅は、プローブポンプ遅延の関数としてLIAからの値を測定し、2つのビーム6、7、8の正確な時間的な重なりに対応する最大値を提供する。結論を出す前に、すべての議論された手順は、高品質の画像を得るために必須であることに留意すべきです。
Protocol
Representative Results
Discussion
SRS顕微鏡は、特に細胞や細胞構造の基礎である脂質などの複雑な生物学的構造の研究において、ラベルフリーイメージングを新たな高みに引き上げました。脂質は、生体膜の産生などの複数の生理学的経路に関与し、生合成前駆体およびシグナルトランスデューサ10として機能する。脂質は、脂質液滴(LD)とも呼ばれる特殊な細胞内小器官に包装されています。その直径は数?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IMM CNRのV.Tufano氏は、貴重な技術支援を受け、ニコンインスツルメンツの製品スペシャリストであるジャコモ・コッツィ氏に対し、有益な議論と継続的なサポートを提供し、感謝しています。この研究は、イタリア国立手術プログラムPONa3 00025(BIOforIU)とユーロバイオイメージング大規模な汎ヨーロッパ研究インフラプロジェクトによって部分的にサポートされました。
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
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