자극된 라만 산란을 기반으로 한 비선형 현미경 구현
Summary
이 원고에서, 레이저 스캐닝 현미경과 SRS 실험 설정의 통합에 의해 얻어진 자극된 라만 산란(SRS) 현미경의 구현이 설명된다. SRS 현미경은 두 개의 펨토초(fs) 레이저 소스, Ti-Sapphire(Ti:Sa) 및 동기화된 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 기반으로 합니다.
Abstract
자극 된 라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 근적외선 여기 광을 사용합니다. 따라서, 그것은 많은 다중 광자 현미경 화상 진찰 속성을 공유합니다. SRS 이미징 양식은 적절한 대역 통과 필터와 잠금 증폭기(LIA) 검출 체계가 있는 비스캔 된 전방 검출기를 장착하여 상업용 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 일반적인 SRS 현미경의 회로도 레이아웃은 다음을 포함합니다: 2개의 펄스 레이저 빔, (즉, 스캐닝 현미경으로 향하는 펌프 및 프로브), 이는 이미지 평면에서 공간과 시간 둘 다에서 중첩되어야 하고, 현미경 목표에 의해 집중되어야 합니다 x-y 평면을 가로질러 초점 지점을 래스터하는 두 개의 스캐닝 미러(SM)를 통해 샘플을 채취한다. 샘플과의 상호 작용 후, 전송된 출력 펄스는 상부 목표에 의해 수집되고 반전된 현미경에 삽입된 전방 검출 시스템에 의해 측정됩니다. 펌프 펄스는 광학 필터 스택에 의해 제거되는 반면, 시편의 초점 부피에서 발생하는 SRS 공정의 결과인 프로브 펄스는 포토다이오드(PD)에 의해 측정됩니다. PD의 판독은 변조 깊이를 추출하기 위해 LIA에 의해 복조됩니다. 2차원(2D) 이미지는 전방 검출 유닛을 현미경 스캐닝 유닛과 동기화하여 수득됩니다. 이 백서에서는 SRS 현미경의 구현이 설명되고 성공적으로 입증되었으며 직경 3 μm의 폴리스티렌 비드의 라벨이없는 이미지의 보고도 설명되고 성공적으로 입증되었습니다. SRS 현미경은 상업적으로 사용할 수 없으므로 이러한 특성을 활용하기 위해 집에서 만든 건설이 유일한 옵션입니다. SRS 현미경 검사법은 많은 분야에서 인기를 끌고 있기 때문에, SRS 현미경 구현의 이 신중한 설명은 과학 적인 사회를 위해 아주 유용할 수 있다는 것을 믿습니다.
Introduction
생명 과학 응용 분야에서 SRS 현미경 검사는 라벨없는 이미징을위한 강력한 도구로 부상했습니다. SRS 현미경 검사법의 기본적인 아이디어는 진동 콘트라스트의 강도와 몇 초 안에 이미지를 획득 하는 기능을 결합 하는 것입니다.
SRS는 두 레이저 빔 주파수 사이의 주파수 차이 (펌프 신호와 다른 주파수에서 스톡 스 신호)가 조사 된 샘플의 분자 진동과 일치하여 자극 된 라만 산란 및 상당한 원인이되는 프로세스입니다. 스톡스 신호가 증가합니다. 선형 라만 분광법과 달리 SRS는 들어오는 광장에 비선형 의존성을 나타내며 일관된 방사선을 생성합니다. SRS에는 두 가지 근본적인 장점이 있습니다: 1) 속도는 샘플 이동 또는 저하로 인해 발생하는 아티팩트에 덜 민감하게 만들고, 2) 우수한 신호 대 잡음 비(SNR)를 제공합니다. 또한, SRS는 자발적라만과 동일한 스펙트럼을 나타내고, SRS 신호는 1, 2,3,4, 화학적 결합의 농도에 선형적으로 비례한다. 5.
우리의 현미경에서, 펨토초 (fs) SRS 실험 설정은 빠른 거울 주사 장치가 장착 된 거꾸로 된광학 현미경과 통합된다 (그림 1)6,7,8. 이 현미경을 구현하기 위해 두 개의 펄스 레이저 소스가 사용됩니다. 첫 번째는 약 140 fs의 펄스 지속 시간, 80 MHz의 반복 속도 및 680-1080 nm 범위의 방출 파장을 가진 fs-Ti:Sa입니다. 두 번째, 프로브 빔으로 사용 및 Ti:Sa에 의해 펌핑, 펨토초 동기화 광학 파라메트릭 발진기 (SOPO), 약의 펄스 지속 시간 200 fs, 80 MHz의 반복 속도, 1000-1600 nm의 범위에서 방출 파장. Ti:Sa와 SOPO 빔 간의 최소 광자 에너지 차이는 2500cm-1입니다. 따라서, 레이저 시스템의 조합을 사용하여, 라만 스펙트럼의 고주파 C-H 영역(2800-3200 cm-1)만이6,7,8을탐색할 수 있다.
SRS 현미경을 설정하기 위해, 연속 단락에 설명되어 있는 3개의 중요한 문제점이 있습니다. 첫 번째는 고주파 변조 전달 방법의 구현이다(설명에 대한 프로토콜의 도 2 및 단계 2.1 참조). SRS 실험 조사에서 중요한 매개 변수는 시스템의 민감도입니다. SRS 신호는 여기 빔의 강도에 작은 변화로 감지; 따라서 레이저 강도 노이즈와 샷 노이즈로 인해 손상될 수 있습니다. 이 문제는 이 시스템을 고주파 변조 전달 방법과 통합하여 극복할 수 있습니다(자세한 내용은 프로토콜의 도 2 및 단계 2.1 참조). 이 방법에서는 전기 광학 변조기(EOM)를 사용하여 펌프를 조절합니다. 프로브 빔으로 전달된 변조는 광학 필터의 스택으로 펌프 빔을 차단한 후 PD에 의해 검출될 수 있다[자극된 라만 게인(SRG) 검출 모드]. PD 출력은 로우 패스 필터로 잠금 증폭기(LIA)에 연결되어 측정된 신호를 강등시됩니다. 빔의 변조 주파수를 1MHz 이상의 주파수로 증가시킴으로써 PD의 본질적 한계를 얻을 수 있습니다.
고려해야 할 두 번째 문제는 전방 검출을 수행하고 동시에 밝은 필드에서 현미경 관측을 보존 할 수있는 기계 마운트의 설치입니다. 또한, 이미지 의 생성 동안 기계적 진동으로 인한 노이즈를 감소시키고 검출 시스템의 정확한 재배치를 허용해야 한다(프로토콜의 도 3 및 2.2 단계 참조).
세 번째는 현미경의 스캔 헤드에 의해 모니터링되는 샘플 에 빔이 위치하여 위상 에 민감한 검출 방식에 의해 획득 된 신호의 동기화입니다. 이미지를 실현하기 위해 SM은 스캔 헤드 유닛에 연결된 현미경 컨트롤러(픽셀 클럭, 라인 동기화 및 프레임 동기화)에서 사용할 수 있는 세 가지 TTL 신호가 필요합니다. 동기화는 PCI 카드,3개의 TTL 신호 및 LIA6,7,8의출력 채널에서 전압 신호의 획득을 사용하여 제어함으로써 달성된다. 수제 소프트웨어가 개발되어 이전6,7,8,동기화 시스템의 하드웨어가 도 4에보고되는 동안 설명했습니다.
SRS 화상 진찰을 수행할 때 기본적인 절차는 현미경 정렬입니다. 그것은 연속된 단락에 설명된 네 단계의 과정을 통해 실현된다. 첫 번째는 두 빔의 공간 중첩입니다(프로토콜의 3.1 단계 참조). 이 실험 적인 설정에서, 두 빔은 공간적으로 이색 거울에 의해 결합되었다. 예비 단계는 각각 현미경에 도달할 수 있도록 OPO및 Ti:Sa의 정렬입니다. 그런 다음 OPO를 참조 빔으로 고려하고 위치 감지 검출기를 활용하면 Ti:Sa가 OPO에 공간적으로 중첩됩니다.
두 번째 중요한 측면은 두 빔의 시간적 중첩입니다(프로토콜의 3.2단계 참조). 펌프와 OPO 빔이 완벽하게 동기화되더라도OPO 하우징 내부에서 약간 다른 빔 경로를 따르기 때문에 OPO 출구에서 약 5 ns의 시간 지연과 5cm의 공간 차이가 있습니다. 따라서 Ti:Sa 및 OPO는 샘플에서 시간적 중복을 보장하기 위해 광학적으로 재시간을 재사용해야 합니다. 이는 일반적으로 미세 조정 가능한 광학 지연 라인으로 수행되며, 이 경우 Ti:Sa와 현미경 사이에 삽입됩니다(그림 1참조). 두 빔의 시간적 중첩을 얻기 위해 두 가지 기술이 사용됩니다. 첫 번째는 빠른 PD와 오실로스코프를 사용하여 수행되고 두 번째는 자동 및 교차 광학 상관 관계를 기반으로 합니다. 첫 번째 기술을 사용하여 두 빔의 거친 중첩(10ps의 불확실성)을 얻는 반면, 두 빔의 정확한 시간 적 중첩은 교차 상관레이터(1 fs의 해상도)를 사용하여 얻어집니다.
세 번째 중요한 양상은 현미경 내부의 두 빔의 정렬입니다 (프로토콜의 3.3 단계 참조). 샘플의 예비 백색광 관찰은 원하는 시야(FOV)를 분할할 수 있습니다. 그 후, 현미경의 측면 포트에 의해 현미경으로 들어가는 레이저 빔은 상부에 장착된 PD에 도달하기위해 정렬됩니다(그림 3). 그러나 올바른 이미지 수집을 위해서는 여러 매개변수(예: 픽셀 크기 및 픽셀 거주 시간)를 설정해야 합니다. 샘플링 주파수는 이미지의 모든 정보를 보존하기 위해 나이퀴스트의 정리에 의해 부과된 제약 조건을 준수해야 하며, 각 픽셀에서 측정된 픽셀과 SRS 값의 공간 좌표 간의 정확한 대응은 통합 시간입니다. LIA는 픽셀 거주 시간과 같거나 비교되어야 합니다.
현미경 정렬의 마지막 단계에서 공간 및 시간 정렬을 최적화하기 위해 수많은 테스트가 수행됩니다 (프로토콜의 3.4 단계 참조). 공간 중복을 최적화하기 위해 Ti:Sa 및 OPO 모두에 대한 다수의 전송 이미지(TI)를 획득합니다. TI에서는 단일 빔이 사용되고 샘플에서 전송된 빔 강도는 PD에 의해 측정됩니다. OPO에 의해 실현 TI의 경우, PD 출력 신호는 PCI 카드에 직접 연결되어, TI의 경우 TI에 의해 실현하는 동안: Ti:Sa, PD 출력 신호는 LIA에 연결되고 LIA의 아날로그 출력은 PCI 카드에 연결됩니다. 전송 이미지는 FOV, 조명, 현미경 목표의 초점 위치를 최적화하고 두 빔이 공간적으로 중첩되는지 확인하는 데매우 유용하다 6,7,8.
펌프 및 프로브 빔의 시간 적 중첩의 최적화는 3.3 fs 시간 이동에 해당하는 0.001 mm의 단계로 지연 라인을 스캐닝하고 직경 3 μm의 폴리스티렌 비드 샘플의 단일 지점에서 SRS 측정을 수행함으로써 얻어진다. SRS 신호의 진폭은 프로브 펌프 지연의 함수로서 LIA로부터값을 측정하고, 두 빔 6,7,8의정확한 시간적 중첩에 대응하는 최대를 제공한다. 결론을 내리기 전에 논의 된 모든 단계는 고품질 이미지를 얻기 위해 필수적이라는 점에 유의해야합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SRS 현미경 검사법은 세포와 세포 건축에 근본적인 지질과 같은 복잡한 생물학 구조물의 연구 결과에서, 특히 새로운 고도에 라벨 자유로운 화상 진찰을 취했습니다. 지질은 생물학적 막의 생산과 같은 여러 생리학적 경로에 관여하며, 이들은 생합성 전구체 및신호 변환기(10)로서 작용한다. 지질은 또한 지질 방울에게 불린 전문화한 세포내 세포기관으로 포장됩니다 (LDs). 그들의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IMM CNR의 V. Tufano는 귀중한 기술 지원과 니콘 인스트루먼트의 제품 전문가인 Giacomo Cozzi에게 유용한 토론과 지속적인 지원을 해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 이탈리아 국립 운영 프로그램 PONa3 00025 (BIOforIU)와 유로 바이오 이미징 대규모 범유럽 연구 인프라 프로젝트에 의해 지원되었다.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
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