Implementierung eines nichtlinearen Mikroskops auf Basis der stimulierten Raman-Streuung
Summary
In diesem Manuskript wird die Implementierung eines stimulierten Raman-Streumikroskops (SRS) beschrieben, das durch die Integration eines SRS-Experimentalaufbaus mit einem Laser-Scanning-Mikroskop gewonnen wurde. Das SRS-Mikroskop basiert auf zwei Femtosekunden (fs) Laserquellen, einem Ti-Sapphire (Ti:Sa) und einem synchronisierten optischen parametrischen Oszillator (OPO).
Abstract
Stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) verwendet Nahinfrarot-Anregungslicht; Daher hat es viele mikroskopische Bildgebungseigenschaften mit mehreren Photonen. Die SRS-Bildgebungsmodalität kann mit kommerziellen Laser-Scanning-Mikroskopen erreicht werden, indem ein nicht gescannter Vorwärtsdetektor mit richtigen Bandpassfiltern und einem Lock-in-Verstärker (LIA)-Erkennungsschema ausgestattet wird. Ein schematisches Layout eines typischen SRS-Mikroskops umfasst Folgendes: zwei gepulste Laserstrahlen (d. h. die Pumpe und sonde, die in einem Rastermikroskop gerichtet sind), die sowohl in Raum als auch Zeit auf der Bildebene überlappen und dann durch ein Mikroskopobjektiv in das Beispiel durch zwei Scanspiegel (SMs), die den Brennpunkt über eine x-y-Ebene rastern. Nach Interaktion mit der Probe werden die übertragenen Ausgangsimpulse durch ein oberes Objektiv erfasst und durch ein Vorwärtsdetektionssystem gemessen, das in ein invertiertes Mikroskop eingesetzt wird. Pumpenimpulse werden durch einen Stapel optischer Filter entfernt, während die Sondenimpulse, die das Ergebnis des SRS-Prozesses im Brennvolumen der Probe sind, mit einer Photodiode (PD) gemessen werden. Die Auslesung der PD wird von der LIA demoduliert, um die Modulationstiefe zu extrahieren. Ein zweidimensionales (2D) Bild wird durch Synchronisieren der Vorwärts-Erkennungseinheit mit der Mikroskop-Scaneinheit erhalten. In diesem Beitrag wird die Implementierung eines SRS-Mikroskops beschrieben und erfolgreich demonstriert, ebenso wie die Meldung von etikettenfreien Bildern von Polystyrolperlen mit Durchmessern von 3 m. Es ist erwähnenswert, dass SRS Mikroskope nicht kommerziell erhältlich sind, so dass, um diese Eigenschaften zu nutzen, die hausgemachte Konstruktion die einzige Option ist. Da die SRS-Mikroskopie in vielen Bereichen immer beliebter wird, wird angenommen, dass diese sorgfältige Beschreibung der Implementierung des SRS-Mikroskops für die wissenschaftliche Gemeinschaft sehr nützlich sein kann.
Introduction
In Life-Science-Anwendungen hat sich die SRS-Mikroskopie als leistungsfähiges Werkzeug für die etikettenfreie Bildgebung herauskristallisiert. Die Grundidee der SRS-Mikroskopie besteht darin, die Stärke des Schwingungskontrasts und seine Fähigkeit, Bilder in wenigen Sekunden zu erfassen, zu kombinieren.
SRS ist ein Prozess, bei dem der Frequenzunterschied zwischen zwei Laserstrahlenfrequenzen (Pumpensignal und Stokes-Signal bei unterschiedlichen Frequenzen) mit der molekularen Schwingung einer untersuchten Probe übereinstimmt, wodurch eine stimulierte Raman-Streuung und eine signifikante Erhöhung des Stokes-Signals. Im Gegensatz zur linearen Raman-Spektroskopie weist SRS eine nichtlineare Abhängigkeit von den eingehenden Lichtfeldern auf und erzeugt kohärente Strahlung. SRS hat zwei grundlegende Vorteile: 1) Geschwindigkeit, die Bilder weniger empfindlich gegenüber Artefakten macht, die durch Probenbewegung oder -degradation entstehen, und 2) ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Darüber hinaus weist SRS ein Spektrum auf, das mit dem spontanen Raman identisch ist, und das SRS-Signal ist linear proportional zur Konzentration der angeregten chemischen Bindung1,2,3,4, 5.
In unserem Mikroskop ist ein Femtosekunden-SRS-Experimentalaufbau mit einem invertierten optischen Mikroskop integriert, das mit einer schnellen Spiegel-Scaneinheit ausgestattet ist (Abbildung 1)6,7,8. Zur Implementierung dieses Mikroskops werden zwei gepulste Laserquellen verwendet. Die erste ist ein fs-Ti:Sa mit einer Pulsdauer von ca. 140 fs, einer Wiederholungsrate von 80 MHz und Emissionswellenlängen im Bereich von 680-1080 nm. Der zweite, der als Sondenstrahl verwendet und von Ti:Sa gepumpt wird, ist ein femtosekundensynchronisierter optischer parametrischer Oszillator (SOPO) mit einer Pulsdauer von ca. 200 fs, einer Wiederholungsrate von 80 MHz und Emissionswellenlängen im Bereich von 1000-1600 nm. Es sollte beachtet werden, dass die minimale Photonenenergiedifferenz zwischen dem Ti:Sa- und SOPO-Strahl 2500 cm-1beträgt. Daher kann mit dieser Kombination von Lasersystemen nur der Hochfrequenz-C-H-Bereich (2800-3200 cm-1) der Raman-Spektren 6,7,8untersucht werden.
Um ein SRS-Mikroskop einzurichten, gibt es drei entscheidende Fragen zu berücksichtigen, die in den aufeinanderfolgenden Absätzen beschrieben werden. Die erste ist die Implementierung einer Hochfrequenzmodulationsübertragungsmethode (siehe Abbildung 2 und Schritt 2.1 des Protokolls für eine Beschreibung). In einer sRS-experimentellen Untersuchung ist ein entscheidender Parameter die Empfindlichkeit des Systems. Ein SRS-Signal wird als kleine Änderung der Intensität der Anregungsstrahlen erkannt; daher kann es durch Laserintensitätsgeräusche und Schussgeräusche beschädigt werden. Dieses Problem kann durch die Integration dieses Systems in eine hochfrequente Modulationsübertragungsmethode behoben werden (Details siehe Abbildung 2 und Schritt 2.1 des Protokolls). Bei diesem Verfahren wird ein elektro-optischer Modulator (EOM) verwendet, um die Pumpe zu modulieren. Die auf den Sondenstrahl übertragene Modulation kann dann von einem PD erfasst werden, nachdem der Pumpenstrahl mit einem Stapel optischer Filter [stimulierter Raman Gain (SRG) Erkennungsmodus] blockiert wurde. Der PD-Ausgang wird über einen Tiefpassfilter mit einem Einsperrverstärker (LIA) verbunden, der das gemessene Signal demoduliert. Durch die Erhöhung der Modulationsfrequenz des Strahls auf Frequenzen über 1 MHz kann die intrinsische Grenze von PDs erreicht werden.
Das zweite zu berücksichtigende Problem ist die Installation einer mechanischen Halterung, die es ermöglicht, eine Vorwärtserkennung durchzuführen und gleichzeitig die Mikroskopbeobachtung im Hellen Feld zu erhalten. Darüber hinaus muss es das Rauschen durch mechanische Vibrationen während der Erzeugung von Bildern reduzieren und eine präzise Neupositionierung des Detektionssystems ermöglichen (siehe Abbildung 3 und Schritt 2.2 des Protokolls).
Die dritte ist die Synchronisation des signals, das durch das phasenempfindliche Detektionsschema erfasst wird, wobei der Strahl auf der Probe positioniert ist, die vom Scankopf des Mikroskops überwacht wird. Um Bilder zu realisieren, benötigen die SMs drei TTL-Signale, die über den mikroskopischen Controller zur Verfügung gestellt werden, der mit der Scankopfeinheit verbunden ist: Pixeluhr, Liniensynchronisierung und Frame-Synchronisation. Die Synchronisation erfolgt durch Steuerung über eine PCI-Karte, die drei TTL-Signale und die Erfassung eines Spannungssignals am Ausgangskanal von LIA6,7,8. Eine hausgemachte Software wurde zuvor entwickelt und beschrieben6,7,8, während die Hardware des Synchronisationssystems in Abbildung 4berichtet wird.
Ein grundlegendes Verfahren bei der Durchführung der SRS-Bildgebung ist die Mikroskopausrichtung. Es wird im Laufe von vier Schritten realisiert, die in den aufeinanderfolgenden Absätzen beschrieben werden. Der erste ist die räumliche Überlappung zweier Balken (siehe Schritt 3.1 des Protokolls). In diesem Versuchsaufbau wurden die beiden Strahlen räumlich durch einen dichroitischen Spiegel miteinander kombiniert. Der vorläufige Schritt ist die Ausrichtung von OPO und Ti:Sa, so dass jeder das Mikroskop erreicht. Wenn man dann OPO als Referenzstrahl betrachtet und einen positionsempfindlichen Detektor ausnutzt, wird der Ti:Sa räumlich mit OPO überlappt.
Der zweite entscheidende Aspekt ist die zeitliche Überlappung zweier Strahlen (siehe Schritt 3.2 des Protokolls). Auch wenn die Pumpe und OPO-Träger perfekt synchronisiert sind9, da sie leicht unterschiedlichen Strahlwegen innerhalb des OPO-Gehäuses folgen, haben sie am OPO-Ausgang eine Zeitverzögerung von ca. 5 ns und eine räumliche Differenz von 5 cm. Daher müssen Ti:Sa und OPO optisch neu getaktet werden, um eine zeitliche Überlappung an der Probe zu gewährleisten. Dies wird in der Regel mit einer fein einstellbaren optischen Verzögerungslinie erreicht, die in diesem Fall zwischen Ti:Sa und Mikroskop eingefügt wird (siehe Abbildung 1). Um die zeitliche Überlappung zweier Strahlen zu erhalten, werden zwei Techniken verwendet. Die erste wird mit einem schnellen PD und Oszilloskop durchgeführt, während die zweite auf auto- und queroptischen Korrelationen basiert. Mit der ersten Technik wird eine grobe Überlappung von zwei Strahlen erhalten (Unsicherheit von 10 ps), während eine genaue zeitliche Überlappung von zwei Strahlen mit einem Kreuzkorrelator (Auflösung von 1 fs) erreicht wird.
Der dritte entscheidende Aspekt ist die Ausrichtung der beiden Strahlen im Mikroskop (siehe Schritt 3.3 des Protokolls). Eine vorläufige Weißlichtbeobachtung der Probe ermöglicht es, das gewünschte Sichtfeld (FOV) zu individualisieren. Anschließend werden Laserstrahlen, die über einen Seitenanschluss des Mikroskops in das Mikroskop gelangen, ausgerichtet, um das am oberen Teil montierte PD zu erreichen (Abbildung 3). Für eine korrekte Bildaufnahme ist jedoch das Festlegen einer Reihe von Parametern erforderlich (z. B. Pixeldimension und Pixelverweilzeit). Die Sampling-Frequenz muss die Durchdrungen von Nyquist-Theorem auferlegte Einschränkung respektieren, um alle Informationen in einem Bild zu erhalten, während für eine korrekte Übereinstimmung zwischen den räumlichen Koordinaten der Pixel und dem sRS-Wert, der in jedem Pixel gemessen wird, die Integrationszeit LIA sollte gleich oder vergleichbar mit der Pixelverweilzeit sein.
Im letzten Schritt der Mikroskopausrichtung werden zahlreiche Tests zur Optimierung der räumlichen und zeitlichen Ausrichtung durchgeführt (siehe Schritt 3.4 des Protokolls). Zur Optimierung der räumlichen Überlappung werden eine Reihe von Übertragungsbildern (TI) für Ti:Sa und OPO erfasst. In einem TI wird ein einzelner Strahl verwendet, und die übertragene Strahlintensität aus der Probe wird durch eine PD gemessen. Im Falle von TI, die von OPO realisiert werden, wird das PD-Ausgangssignal direkt an die PCI-Karte angeschlossen, während im Fall von TI:Sa das PD-Ausgangssignal an LIA und der analoge Ausgang von LIA an die PCI-Karte angeschlossen ist. Die Übertragungsbilder sind sehr nützlich, um den FOV, die Beleuchtung, die Brennposition von Mikroskopobjektiven zu optimieren und zu überprüfen, ob die beiden Strahlen räumlich überlappend sind6,7,8.
Die Optimierung der zeitlichen Überlappung von Pumpe und Sondenstrahl wird durch Scannen der Verzögerungslinie mit Schritten von 0,001 mm, die einer 3,3-fs-Zeitverschiebung entsprechen, und Durchführung einer SRS-Messung an einem einzigen Punkt einer Polystyrol-Perlenprobe mit einem Durchmesser von 3 m erreicht. Die Amplitude eines SRS-Signals misst in Abhängigkeit von der Sonden-Pumpen-Verzögerung Werte aus LIA und liefert eine maximale zeitliche Überlappung der beiden Strahlen6,7,8. Vor dem Abschluss ist zu beachten, dass alle diskutierten Schritte obligatorisch sind, um ein qualitativ hochwertiges Bild zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die SRS-Mikroskopie hat die etikettenfreie Bildgebung in neue Höhen gehoben, insbesondere in Studien komplexer biologischer Strukturen wie Lipide, die für Zellen und zelluläre Architektur von grundlegender Bedeutung sind. Lipide sind an mehreren physiologischen Wegen wie der Produktion biologischer Membranen beteiligt und dienen als biosynthetische Vorläufer und Signalwandler10. Lipide werden in spezialisierte intrazelluläre Organellen verpackt, auch Lipidtröpfchen (LDs) genannt. Ihre Durchm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir schätzen V. Tufano von IMM CNR für seine wertvolle technische Unterstützung und Giacomo Cozzi, Produktspezialist von Nikon Instruments, für nützliche Diskussionen und kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von den italienischen Nationalen Operativen Programmen PONa3 00025 (BIOforIU) und dem großangelegten europaweiten Forschungsinfrastrukturprojekt Euro-Bioimaging unterstützt.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
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