Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten
Summary
Sequentie specificiteit is essentieel voor genregulatie. Regelgevende eiwitten die specifieke sequenties herkennen zijn belangrijk voor genregulatie. Het definiëren van functionele binding sites voor dergelijke eiwitten is een uitdagend biologisch probleem. Een iteratieve benadering voor de identificatie van een bindingsplaats voor een RNA-bindend eiwit wordt hier beschreven en is toepasbaar op alle RNA-bindende eiwitten.
Abstract
Genregulatie speelt een belangrijke rol in alle cellen. Transcriptionele, post-transcriptionele (of RNA processing), translationele en post-translationele stappen worden gebruikt om specifieke genen te reguleren. Sequentie-specifieke nucleïnezuur-bindende eiwitten targeten specifieke sequenties om ruimtelijke of temporele genexpressie te beheersen. De binding sites in nucleïnezuren worden meestal gekenmerkt door mutationele analyse. Echter, talrijke eiwitten van belang hebben geen bekende binding site voor dergelijke karakterisering. Hier beschrijven we een aanpak om eerder onbekende binding sites te identificeren voor RNA-bindende eiwitten. Het gaat om iteratieve selectie en versterking van sequenties beginnend met een gerandomiseerde sequentie pool. Na een aantal rondes van deze stappen-transcriptie, binding en amplificatie-worden de verrijkte sequenties geordend om een voorkeurs binding site (s) te identificeren. Succes van deze aanpak wordt bewaakt met behulp van in vitro bindende assays. Vervolgens kunnen in vitro en in vivo Functionele assays worden gebruikt om de biologische relevantie van de geselecteerde sequenties te beoordelen. Deze aanpak maakt identificatie en karakterisering mogelijk van een eerder onbekende binding site (s) voor elk RNA-bindend eiwit waarvoor een test voor het scheiden van proteïne-gebonden en niet-afhankelijke Rna’s bestaat.
Introduction
In celbiologie speelt genregulatie een centrale rol. Bij een of meerdere stappen langs het genexpressie traject hebben genen het potentieel om gereguleerd te worden. Deze stappen omvatten transcriptie (initiatie, rek en beëindiging), evenals splicing, polyadenylering of 3 ‘ end Formation, RNA export, mRNA vertaling, en verval/lokalisatie van primaire transcripten. Op deze stappen moduleren nucleïnezuur-bindende eiwitten genregulatie. Identificatie van bindende plaatsen voor dergelijke eiwitten is een belangrijk aspect van het bestuderen van gencontrole. De vergelijking van mutational analyse en fylogenetische sequentie is gebruikt om regelgevings sequenties of eiwit bindende locaties in nucleïnezuren te ontdekken, zoals promotors, Splice sites, polyadenylatie elementen en translationele signalen1, 2 , 3 , 4.
Pre-mRNA splicing is een integrale stap tijdens genexpressie en regulatie. Het merendeel van de zoogdier genen, ook bij mensen, heeft introns. Een groot deel van deze Transcripten is ook gesplitst, waardoor meerdere mRNA-en proteïne-isovormen uit hetzelfde gen of primaire transcript worden geproduceerd. Deze isovormen hebben celspecifieke en ontwikkelings rollen in de celbiologie. De 5 ‘ splice site, de tak-Point, en de polypyrimidine-Tract/3 ‘ splice site zijn kritische splicing signalen die onderworpen zijn aan regulering. In negatieve regulatie wordt een anderszins sterke Splice site onderdrukt, terwijl in positieve regulatie een anderszins zwakke Splice site wordt geactiveerd. Een combinatie van deze gebeurtenissen produceert een overvloed aan functioneel verschillende isoforms. RNA-bindende eiwitten spelen belangrijke rollen in deze alternatieve splicing-gebeurtenissen.
Er zijn talrijke eiwitten bekend waarvan de bindende plaats (en) of RNA-doelen nog steeds worden geïdentificeerd op5,6. Het koppelen van regelgevende eiwitten aan hun downstream biologische doelen of sequenties is vaak een complex proces. Voor dergelijke eiwitten is identificatie van hun doel RNA of bindingsplaats een belangrijke stap in het bepalen van hun biologische functies. Zodra een binding site is geïdentificeerd, kan deze verder worden gekarakteriseerd met behulp van standaard moleculaire en biochemische analyses.
De hier beschreven aanpak heeft twee voordelen. Ten eerste kan het een eerder onbekende binding site identificeren voor een eiwit van belang. Ten tweede, een bijkomend voordeel van deze aanpak is dat het tegelijkertijd verzadiging mutagenese toestaat, die anders arbeidsintensief zou zijn om vergelijkbare informatie te verkrijgen over de sequentie vereisten binnen de binding site. Zo biedt het een sneller, gemakkelijker en minder kostbaar hulpmiddel om eiwit bindende sites in RNA te identificeren. Oorspronkelijk werd deze aanpak (Selex of systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking) gebruikt om de bindingsplaats te karakteriseren voor de bacteriofaag T4 DNA polymerase (Gene 43 Protein), die overlapt met de ribosoom binding site in zijn eigen mRNA. De binding site bevat een 8-base lus reeks, die 65.536 gerandomiseerde varianten voor analyse7vertegenwoordigt. Ten tweede werd de benadering ook onafhankelijk gebruikt om aan te tonen dat specifieke bindingsplaatsen of aptamers voor verschillende kleurstoffen kunnen worden geselecteerd uit een pool van ongeveer 1013 sequenties8. In feite is deze aanpak in veel verschillende contexten algemeen gebruikt om aptamers (RNA-of DNA-sequenties) te identificeren voor het binden van talrijke liganden, zoals eiwitten, kleine moleculen en cellen, en voor katalyse9. Als voorbeeld kan een aptamer discrimineren tussen twee xanthinederivaten, cafeïne en theofylline, die verschillen door de aanwezigheid van één methylgroep in cafeïne10. We hebben deze aanpak uitgebreid gebruikt (SELEX of iteratieve selectie-amplificatie) om te bestuderen hoe RNA-bindende eiwitten functioneren in splicing of splicing Regulation11, die de basis zal zijn voor de discussie hieronder.
De Random Library: we gebruikten een willekeurige bibliotheek van 31 nucleotiden. De lengte overweging voor de Random Library was losjes gebaseerd op het idee dat de algemene splicing factor U2AF65 bindt aan een sequentie tussen de vertakkingspunt sequentie en de 3 ‘ splice site. Gemiddeld is de afstand tussen deze splicing signalen in figuur in het bereik van 20 tot 40 nucleotiden. Een ander eiwit geslacht-dodelijk was bekend om te binden aan een slecht gekarakteriseerde regelgevings sequentie in de buurt van de 3 ‘ splice site van zijn doelwit Pre-mRNA, transformator. Zo kozen we voor een willekeurige regio van 31 nucleotiden, geflankeerd door primer bindingsplaatsen met restrictie-enzym locaties om PCR-versterking en bevestiging van de T7 RNA polymerase Promoter voor in vitro transcriptie mogelijk te maken. De theoretische bibliotheek grootte of complexiteit bedroeg 431 of ongeveer 1018. We gebruikten een kleine fractie van deze bibliotheek om onze willekeurige RNA-pool voor te bereiden (~ 1012-1015) voor de hieronder beschreven experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nucleïnezuur-bindende eiwitten zijn belangrijke regulatoren voor de ontwikkeling van dieren en planten. Een belangrijke eis voor de SELEX-procedure is de ontwikkeling van een test die kan worden gebruikt om eiwit afhankelijke en ongebonden RNA-fracties te scheiden. In principe kan deze test een in vitro bindende assay zijn, zoals de filter bindings test, de gel Mobility Shift assay of een matrix binding assay19 voor recombinant-eiwitten, gezuiverde eiwitten of eiwitcomplexen. De test kan ook een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur dankt de National Institutes of Health voor de financiering uit het verleden.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3′ end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5′-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. , (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).
