Estrazione di Cortisol da Sturgeon Fin e Matrici Jawbone
Summary
In questo studio, presentiamo un protocollo per l’estrazione del cortisolo dalla pinna e mascella delle specie di storione. I livelli di cortisolo di pinna e mascella sono stati ulteriormente esaminati confrontando due solventi per il lavaggio seguiti dai saggi ELISA. Questo studio ha sperimentato la fattibilità del cortisolo mascellare come un nuovo indicatore di stress.
Abstract
Gli obiettivi di questo studio erano di sviluppare una tecnica per l’estrazione del cortisolo dalle pinne di storione utilizzando due solventi di lavaggio (acqua e isopropanolo) e quantificare eventuali differenze nei livelli di cortisolo tra tre specie di storione principali. Le pinne sono state raccolte da 19 storioni sacrificati tra cui sette beluga (Huso huso), sette siberiani (Acipenser baerii), e cinque sevruga (A. stellatus). Gli storioni sono stati raccolti nelle aziende agricole iraniane per 2 anni (2017-2018), e l’analisi dell’estrazione del cortisolo è stata condotta in Corea del Sud (gennaio-febbraio 2019). Le ossa della Mascella di cinque H. huso furono usate anche per l’estrazione del cortisolo. I dati sono stati analizzati utilizzando la procedura glM (General Linear Model) nell’ambiente SAS. I coefficienti di variazione intra-e inter-saggio sono stati rispettivamente di 14,15 e 7,70. In breve, la tecnica di estrazione del cortisolo prevedeva il lavaggio dei campioni (300 x 10 mg) con 3 mL di solvente (acqua ultrapura e isopropanolo) due volte, rotazione a 80 giri/ per 2,5 min, asciugatura d’aria dei campioni lavati a temperatura ambiente (22-28 gradi centigradi) per 7 giorni, ulteriore i campioni che utilizzano un battitore di perline a 50 Hz per 32 min e li macinano in polvere, applicando 1,5 mL di metanolo alla polvere essiccata (75 x 5 mg) e una rotazione lenta (40 giri/) per 18 h a temperatura ambiente con miscelazione continua. Dopo l’estrazione, i campioni sono stati centrifugati (9.500 x g per 10 min), e 1 supernatante mL è stato trasferito in un nuovo tubo di microcentrifuga (1,5 mL), incubato a 38 gradi centigradi per far evaporare il metanolo e analizzato tramite l’analisi immunosorante legata agli enzimi (ELISA) . Non sono state osservate differenze nei livelli di cortisolo delle pinne tra le specie o nei livelli di cortisolo a pinna e mascella tra i solventi di lavaggio. I risultati di questo studio dimostrano che la matrice della mascella dello storione è un indicatore di sollecitazione alternativa promettente alle matrici solide.
Introduction
Cortisolo è un indicatore affidabile dello stress animale. L’estrazione del cortisolo fornisce un quadro valido per i ricercatori per monitorare i livelli di stress e modelli generali nei fattori di stress. Ad esempio, studi precedenti hanno condotto la convalida metodologica delle misurazioni del cortisolo dei capelli utilizzando vari metodi in esseri umani1,2, scimmie3,4, bovini5, pecore6, e pesce rosso7,8. Nelle specie ittiche, le misurazioni del cortisolo in matrici come squame, muco cutaneo, feci e sangue9 hanno dimostrato di fornire informazioni sulla salute dei pesci. Quando il campionamento del sangue è problematico o mancano le scale, sono necessarie matrici alternative per l’estrazione del cortisolo. Nei pesci, matrici alternative possono includere la mascella, un tessuto duro simile al dente umano10.
Lo sviluppo di nuove matrici e tecniche convalidate per determinare i livelli di stress del pesce è di particolare interesse per l’industria del caviale, dove lo storione può sperimentare un’esposizione prolungata a fattori di stress ambientale11. Il sesso di storione non può essere determinato prima dei 2 anni di età, e lo storione non ha squame. Poiché il cortisolo si accumula gradualmente in matrici solide durante la fase di crescita2,7,12, i dati di accumulo di cortisolo a lungo termine da matrici dure come pinne e mascelle potrebbero fornire informazioni sullo stress diverse fasi di crescita. Al contrario, i livelli di cortisolo nel sangue forniscono un’istantanea dei livelli di stress al momento della morte e non possono rappresentare con precisione lo stress durante le condizioni di allevamento a lungo termine13,14. Con l’aumento della concorrenza nel mercato dei caviale, nuovi approcci per migliorare le condizioni di stress per la produzione di ovuli più sani tra le specie di storione durante l’allevamento a lungo termine (8-12 anni o più) sono un’area di ricerca sempre più importante. A causa dell’elevato costo dello storione, i campioni raccolti sono estremamente costosi (8.000-15.000 dollari per pesce maturo a seconda delle specie e della fase di crescita), un fattore limitante per i progetti di ricerca. Tuttavia, lo sviluppo di una tecnica appropriata per l’estrazione del cortisolo dalle pinne di storione e dalle mascelle potrebbe essere utilmente applicato sia ai sistemi di allevamento ittico che ai pesci selvatici per migliorare la qualità e la raccolta delle uova di storione sia per il consumo che per conservazione.
Oltre a fornire risultati affidabili6, la selezione di un’adeguata tecnica di estrazione del cortisolo è di fondamentale importanza per garantire che altri composti presenti nella matrice durante la preparazione del campione non confondano l’output, il che potrebbe portare a risultati incoerenti. È altrettanto importante determinare se i livelli di cortisolo pinna e mascella sono influenzati dai livelli di ormone nell’acqua circostante. L’Heimbàrge et al.15 ha suggerito che una serie di fattori possono influenzare i livelli di cortisolo tra cui età, sesso, gravidanza, stagione, colore12e regione del corpo da cui il cortisolo viene estratto16. Tuttavia, sono disponibili poche informazioni sugli effetti dei solventi per il lavaggio sull’estrazione del cortisolo nelle matrici del corpo dei pesci8e nessuna su questi effetti nello storione, fatta eccezione per le uova di storione17.
Anche se l’analisi dei livelli di cortisolo di base dalle pinne e dalle ossa mascellari dello storione richiede che il pesce sia eutanasia, questo approccio non comporta le tecniche invasive necessarie per il campionamento del sangue nello storione vivo. I campioni di pinne e mascelle sono facilmente raccolti e l’estrazione da questi tessuti può essere eseguita rapidamente. Allo stesso modo, l’estrazione e l’analisi degli ormoni sono semplici e richiedono poche attrezzature specializzate.
In questo studio, presentiamo una nuova tecnica e facilmente applicata per l’estrazione, il lavaggio e la determinazione del cortisolo dalle pinne di pesce e dalle mascelle, con l’obiettivo di determinare se i livelli di cortisolo misurati da queste matrici possono essere utilizzati in modo affidabile come stress Indicatori. I vantaggi di questa tecnica includono un approccio8 facile e non invasivo, meno variazioni di dati e uscita affidabile1,6,8,17; la tecnica è applicabile alle specie ittiche senza squame come lo storione. La tecnica richiede la macellazione del pesce, la selezione di adeguati solventi di lavaggio2,4, corretta macinazione dei campioni3,5, saggio immunosorbente enzimatico professionale (ELISA) applicazione5,7, e una vasta conoscenza dell’incorporazione di fonti di cortisolo in matrici solide6.
Abbiamo applicato due diversi solventi per il lavaggio (acqua ultrapura e isopropanolo) per ottenere livelli di cortisolo basale nelle pinne da tre specie di storione: beluga (Huso huso), Siberian (Acipenser baerii), e sevruga (A. stellatussa ), in condizioni ambientali standard per ciascuna specie. Le ossa di H. huso furono usate anche per valutare lo stress nello storione. Questo è il primo studio per misurare i livelli di cortisolo nelle ossa mascellari di storione. I risultati di questo studio forniranno dati comparativi di cortisolo per le specie di storione nella fase di crescita precoce (1 anno) prima della determinazione del sesso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sturgeon è talvolta chiamato un “fossile vivente” perché ha mostrato pochi adattamenti nel corso dei millenni passati. Il genere storione Acipenser contiene 27 specie che producono caviale; tuttavia, tre specie (beluga, baerii e sevruga) producono la maggior parte dell’approvvigionamento di caviale globale. Gli storioni sono vulnerabili alla pesca eccessiva e alle interferenze nel loro habitat naturale e sono quindi più a rischio di estinzione di qualsiasi altro gruppo di specie. Sturgeon appartiene al più a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato condotto con il supporto del Programma di Ricerca Cooperativa per l’Agricoltura Scienza & Sviluppo Tecnologico (titolo del progetto: Analisi della produttività del bestiame con il cambiamento climatico, Progetto n. PJ012771), Amministrazione dello sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Inoltre, questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione (No. PJ01344604) dell’Animal Nutrition & Physiology Team, Istituto Nazionale di Scienze Animali, RDA, Seoul, Repubblica di Corea. Gli autori riconoscono con gratitudine il CEO dei gesti persiani Mohammad Hassan Salmanzadeh e il suo team, che ha fornito pesce delle tre specie di storione esaminate in questo studio.
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
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