Summary
Aquí, describimos un método para inducir la meningitis meningocócica a través de una vía intracisternal de infección en ratones adultos. Presentamos un protocolo paso a paso de la infección meningocócica desde la preparación del inóculo hasta la infección intracisternal; luego registrar la supervivencia animal y evaluar las cargas bacterianas en los tejidos murinos.
Abstract
Neisseria meningitidis (meningococo) es un microorganismo de rango estrecho, reconocido mundialmente como la principal causa de meningitis bacteriana. El meningococo es un colonizador transitorio de la nasofaringe humana de aproximadamente el 10% del sujeto sano. En circunstancias particulares, adquiere una capacidad invasiva para penetrar la barrera mucosa e invade el torrente sanguíneo causando septicemia. En el último caso, la sepsis fulminante podría surgir incluso sin el consiguiente desarrollo de la meningitis. Por el contrario, las bacterias podrían multiplicarse mal en el torrente sanguíneo, cruzar la barrera hematoencefálica, alcanzar el sistema nervioso central, lo que conduce a la meningitis fulminante. Los modelos murinos de meningitis bacteriana representan una herramienta útil para investigar las interacciones huésped-patógeno y analizar los mecanismos patogenéticos responsables de esta enfermedad letal. Aunque se han evaluado varios sistemas modelo experimentales en las últimas décadas, ninguno de ellos fue capaz de reproducir los eventos patológicos característicos de la enfermedad meningocócica. En este protocolo experimental, describimos un procedimiento detallado para la inducción de la meningitis meningocócica en un modelo de ratón basado en la inoculación intracisternal de bacterias. Los signos peculiares de la meningitis humana se registraron en el huésped murino mediante la evaluación de parámetros clínicos (por ejemplo, temperatura, peso corporal), evaluación de la tasa de supervivencia, análisis microbiológico y examen histológico de lesiones cerebrales. Cuando se utiliza inóculo intracisternal (i.cist.), meningococci entrega completa directamente en cisterna magna, lo que conduce a una replicación meningocócica muy eficiente en el tejido cerebral. Se observa un aumento de 1.000 veces por el recuento viable de bacterias en aproximadamente 18 h. Por otra parte, los meningococos también se encuentran en el bazo, y el hígado de ratones infectados, lo que sugiere que el hígado puede representar un órgano diana para la replicación meningocócica.
Introduction
Neisseria meningitidis es un Gram negativo-proteobacterium restringido al huésped humano, bien conocido por ser una de las causas más comunes de meningitis y sepsis en la población humana en todo el mundo. Coloniza el tracto respiratorio superior (nariz y garganta) de portadores sanos y asintomáticos (2-30% de la población), pero la bacteria a veces evade varias defensas inmunitarias del huésped y se propaga desde el torrente sanguíneo al cerebro causando un inflamación, conocida como meningitis meningocócica. Una combinación de factores huésped y bacterianos parece contribuir a la transición de la comensal al comportamiento invasivo1.
N. meningitidis está especializada exclusivamente en la colonización humana y la infección. Tiene un rango de huésped estrecho y, por lo tanto, tiene estudios de patogénesis in vivo limitadodebidodebido a la falta de modelos animales adecuados que reproduzcan la enfermedad meningocócica humana. Como resultado, había dado lugar a lagunas fundamentales en la comprensión relativa a la patogénesis de la septicemia y la meningitis causada por el meningococo. En las últimas décadas, el desarrollo de muchos sistemas in vitro permitió la identificación de varios factores de virulencia meningocócica2,3,4. Aunque estos valiosos estudios proporcionaron información importante para entender el papel de estos factores para una infección meningocócica exitosa, estos modelos no permitieron evaluar las consecuencias de las interacciones bacterianas con el humor y celular sistema inmunológico y aún menos con todo el tejido. Los modelos animales in vivo de infección son de gran importancia también para la evaluación del grado de protección conferido por las formulaciones de vacunas. Como patógeno humano-trópico, el meningococo posee determinantes apropiados necesarios para una infección exitosa, como estructuras superficiales (es decir, proteínas pili y de opacidad tipo IV) y sistemas de admisión de hierro para receptores humanos y proteínas de transporte (es decir, transferrina y lactoferrina)5,6,7 para adherirse adecuadamente, sobrevivir e invadir el huésped humano. Por último, las capacidades de variación genética del patógeno para evadir y/o bloquear la respuesta inmune humana contribuyen aún más al alto tropismo de especies8,9. Por lo tanto, la ausencia de factores de huésped específicos, involucrados en la interacción, puede bloquear los pasos del ciclo de vida del patógeno, estableciendo dificultades significativas en el desarrollo de pequeños modelos animales que resumen el ciclo de vida meningocócico.
En las últimas décadas, se han desarrollado varios enfoques para mejorar nuestra comprensión del ciclo infeccioso meningocócico. Las infecciones de dos modelos animales, ratón y rata, ya sea intraperitonealmente (i.p.) o intranasal (es decir), se desarrollaron para reproducir la enfermedad meningocócica10,11,12,13,14 ,15,16,17. El ratón de laboratorio es probablemente uno de los animales más versátiles para inducir una infección meningocócica experimental.
Sin embargo, la vía i.p. de infección conduce al desarrollo de sepsis grave, aunque no imita la vía natural de la infección, mientras que la vía i.n. de la infección fue útil para evaluar la patogénesis meningocócica, aunque puede inducir una infección pulmonar antes de la sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
El modelo de ratón i.p. fue fundamental para evaluar la protección contra el desafío meningocócico10,11,12. El modelo de ratón de colonización meningocócica basada en la vía i.n. de la infección se ha desarrollado con ratones lactantes, ya que son más susceptibles a los meningococos, para reproducir una infección invasiva imitando el curso de la enfermedad meningocócica en humanos 13,14,15,16,17. Además, para promover la replicación meningocócica en el huésped murino, también se aplicó un número creciente de estrategias técnicas, incluida la administración del hierro a los animales para mejorar la infección, el uso de inóculobacteriano alto, cepa bacteriana pasada por ratón, así como el empleo de huéspedes animales lactantes o inmunocomprometidos10,13,15,18,19. La expresión de factores humanos específicos como CD4620 o transferrina21 ha aumentado la susceptibilidad de los ratones a esta bacteria del trópico humano; el empleo del modelo de infección de xenoinjerto de piel humana también ha sido útil para evaluar la capacidad de adhesión de los meningococos al endotelio humano22,23. Colectivamente, el reciente desarrollo de ratones transgénicos humanizados ha mejorado la comprensión de la patogénesis meningocócica y sus interacciones de huésped.
Anteriormente, desarrollamos un modelo murino de meningitis meningocócica donde la inoculación de bacterias se realizaba en la cisterna magna de ratones adultos con bacterias pasajeras de ratón24. Los parámetros clínicos y la tasa de supervivencia de los ratones infectados demostraron el establecimiento de meningitis con características comparables a las que se ven en el huésped humano, así como los análisis microbiológicos e histológicos del cerebro. De estos ratones infectados, las bacterias también se recuperaron de la sangre, el hígado y el bazo, y las cargas bacterianas de los órganos periféricos correlacionados con la dosis infecciosa. En particular, este modelo se empleó para evaluar la virulencia de una cepa mutante isogénica defectuosa en el transportador L-glutamato GltT24. Recientemente, utilizando nuestro modelo de ratón de meningitis meningocócica basado en i.cist. ruta con cepa serogrupo C 93/42862,24 y un mutante isogénico defectuoso en codificación de genes cssA para UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa25, hemos analizado el papel del ácido siálico expuesto en el establecimiento enfermedad en ratones.
En este protocolo, describimos un método sencillo para inducir meningitis meningocócica experimental basada en el i.cist. vía de infección en ratones adultos Balb/c. Este método es particularmente útil para la caracterización de la infección meningocócica en un huésped murino, así como para la evaluación de la virulencia entre cepas de referencia de tipo silvestre y mutantes isogénicos. La vía intracisternal de la infección asegura la entrega completa de los meningococos directamente en la cisterna magna, lo que a su vez facilita la replicación bacteriana en el líquido cefalorraquídeo (LCR) e induce meningitis con características que imitan a las presente en humanos2,24,25,26.
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Protocol
Este protocolo se llevó a cabo para minimizar el sufrimiento animal y reducir el número de ratones de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE). Los experimentos in vivo reportados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Éticos (Prot. número 2, 14 de diciembre de 2012) y el Ministerio de Salud de Italia (Prot. número 0000094-A-03/01/2013). Todos los procedimientos deben realizarse dentro del Gabinete de Bioseguridad 2 (BSC2) en una sala BSL2, y los posibles residuos infectados deben eliminarse en contenedores específicos.
1. Infección de ratones con N. meningitidis Serogroup C Strain
ADVERTENCIA: N. meningitidis es potencialmente un patógeno nocivo y se deben tomar todas las precauciones necesarias al manipular este microorganismo. Toda la experimentación requiere la contención de nivel 2 de bioseguridad (BSL2). El investigador involucrado en estudios con animales debe usar equipo de protección personal desechable (EPP) durante el experimento.
- Preparación de bacterias para estudios de infección in vivo
- Elija una sola colonia de un cultivo fresco de Neisseria meningitidis en placa de agar GC (Gonococcal) complementada con 1% (vol/vol) suplemento de polivitox e inocular en 10 mL de caldo GC.
- Cultivar las bacterias a 37 oC en una incubadora de agitador orbital con una velocidad de 220 rpm. Sigue revisando el O.D. de la cultura con un espectrofotómetro. Cultivar el cultivo hasta la fase exponencial temprana a una densidad óptica OD600nm de 0,7, correspondiente a 7 x 108 CFU/ml.
- Una vez obtenido el D.O. requerido, haga las existencias congeladas añadiendo un 10% de glicerol. Dispensar 1 ml de la cultura en los crioviales. Conservar los viales a -80oC hasta su uso.
NOTA: Aunque es mejor utilizar el cultivo bacteriano fresco, las existencias congeladas se utilizaron para simplificar y estandarizar el experimento in vivo. Por lo general, las existencias congeladas se han empleado dentro de aproximadamente 6 meses desde la preparación. - Antes de la infección, descongelar las bacterias congeladas a temperatura ambiente.
- Cosecha las células bacterianas por centrifugación durante 15 min a 1.500 x g y resuspende en 1 ml de caldo GC fresco que contenga desnrón de hierro (5 mg/kg).
NOTA: El caldo GC se prepara con la adición de desmolde de hierro (5 mg/kg) con el fin de favorecer la replicación de meningococos en el tejido huésped14,18,27. - Antes de usar, realizar recuentos viables de bacterias para determinar el número exacto de Ufc para la infección. Para ello, recoger 10 oL de suspensión bacteriana y proceder con diluciones en serie y extender cada dilución en placas de agar GC e incubar a 37 oC con 5% co2,durante 18-24 h.
- Inyección intracisternal de ratones
Nota:Todo el procedimiento se realiza en el armario de flujo laminar para mantener condiciones asépticas.- Ratones de laboratorio domésticos (8 semanas de edad, hembra Balb/c) bajo condiciones específicas libres de patógenos. Proporcione pellets de alimentos y agua ad libitum.
- Resolver los animales en el nuevo entorno durante 1 semana antes de comenzar el experimento.
- Antes de comenzar el experimento, sopesar y evaluar su temperatura corporal.
NOTA: Los ratones hembra endogámicos Balb/c de ocho semanas de edad pesan un promedio de unos 19 g. La temperatura media de los ratones de laboratorio fisiológicamente oscila entre 36-38 oC24. - Estruja al animal del cuello, limpia la zona del abdomen con el 70% de etanol e inyecta un deextrano de hierro i.p. (disuelto en tampón de solución salina de fosfato al 1 %, 250 mg/kg) en el cuadrante inferior derecho del abdomen murino usando una aguja de 25 G 0,5 mm x 16 mm , aproximadamente 2-3 h antes de la infección.
NOTA: La inyección intraperitoneal se realizó en el cuadrante inferior derecho del abdomen murino para evitar dañar los órganos abdominales como vejiga urinaria, cecum, etc. La administración de fuente de hierro exógena, en forma de desnrón de hierro, a los animales antes de la infección favorece la multiplicación bacteriana en el huésped14,18,27. - Después de 2-3 h, realizar anestesia animal con ketamina (50 mg/kg) y xilazina (3 mg/kg) y lubricante oftálmico.
- Compruebe la profundidad de la anestesia asegurando la ausencia de respuesta al dolor al pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del día.
- Coloque el ratón en decúito esternal y estire cuidadosamente las extremidades y la columna cervical para mantener la columna vertebral en una posición recta.
- Mezcle suavemente la suspensión bacteriana para mantener una suspensión constante antes de cargar una jeringa de 30 G de aguja x 8 mm.
NOTA: Preparar la suspensión bacteriana lo más cerca posible del tiempo de inyección; mientras tanto, guárdelo a temperatura ambiente. - Sobre la base del mareado bacteriano posterior a la descongelación (CFU/ml), proceder al cálculo del total de ufc cfu a utilizar, con respecto al número total de animales a infectar (dosis bacteriana de la CFU por número de animales). Proceder con el cálculo del volumen exacto a tomar del vial para obtener la UFC total aplicando una proporción entre el titer bacteriano posterior a la descongelación (CFU/ml) y el total de UFC útil para la infección de n ratones (post descongelación de la CFU bacteriana : ml - CFU total : x). Establecer el volumen final con respecto al número total de animales a infectar.
NOTA: En estos experimentos, se utilizó una amplia gama de titer de 104 a 109 por animal. - Limpie el área quirúrgica con 70% de etanol.
- Identificar el punto de inyección con la ayuda de una aguja e inyectar la CFU establecida de meningococos (cepa de tipo salvaje y cepa mutante isogénica), o caldo GC complementado con deextran de hierro (5 mg/kg) como control, en un volumen total de 10 ol en la cisterna magna de los ratones a través de un orificio de rebaba occipital utilizando una aguja de 30 G x 8 mm.
- Realice el inóculo cisternal colocando la aguja en la unión craneocervical, específicamente en el espacio subaracnoideo dorsal. Ventroflex la cabeza para hacer este espacio accesible28.
- Brevemente, coloque al animal en recumbencia lateral, sostenga las orejas fuera del camino y flexione el cuello moderadamente (90 a 100o). Asegúrese de que la línea media del cuello y la cabeza (desde la nariz hasta el occipucio) estén perfectamente paralelas a la mesa.
- Toque las alas del atlas y asegúrese de que se superponen, eliminando la rotación axial. Una sangría natural generalmente se puede tocar en la línea media donde es más probable que la aguja entre en el orificio occipital.
- Deseche la jeringa y la aguja de forma segura después de la inyección de ratones con Neisseria.
- Coloque el animal en la jaula y espere el despertar y la recuperación completa del movimiento.
- Mantenga las jaulas con ratones infectados bajo un gabinete de flujo laminar.
- Monitorizar ratones, 24 h después de la infección, para signos clínicos de coma según la escala de coma29. Escala de coma: 1o de coma, 2o no se para erguido después de girar la espalda, 3o se para erguido dentro de 30 s, 4o se mantiene erguido dentro de 5 s, actividades ambulatorias mínimas, 5o normal.
NOTA: Cuando se registraba dolor en animales, se administró analgesia con meloxicam (5 mg/kg i.p. para la duración del estudio). - Proceder para la supervivencia animal o cFU cuenta el ensayo en los animales infectados como se detalla en el paso 2.
- Realizar la eutanasia de ratones con una puntuación de 2 por luxación cervical y registrar como muerto para el análisis estadístico.
2. La supervivencia animal y los recuentos de ufcs
-
Supervivencia animal
- Preparar la inocula bacteriana a diferentes dosis (que van desde 104 a 109 UFC por ratón) para infectar a los animales por el i.cist. ruta (véase el paso 1.2).
- Ratones de control de inoculación con caldo GC, complementado con deextran de hierro (5 mg/kg), de la misma manera.
- Monitorizar animales para síntomas clínicos: piel con volantes, apariencia encorvada, hipotermia, pérdida de peso, letargo, o moribundo24,25,26,30, todos los días durante todo el experimento durante 168 h (7 días) al menos dos veces al día durante la duración del experimento.
- Mida el peso corporal y la temperatura utilizando un equilibrio digital y un termómetro rectal, respectivamente todos los días.
- Registrar la supervivencia de los ratones durante una semana.
NOTA: Registre la muerte natural de la infección por animales después de que los animales que alcanzan un valor de coma de 2 o que sobrevivan más de 168 h de observación serán eutanasiados. - Anestetizar ratones con un valor de coma de 2 o que sobrevivan durante el tiempo de observación con ketamina (50 mg/kg) y xilazina (3 mg/kg) y aplicar pomada oftálmica.
- Compruebe que la respuesta del dolor esté ausente por pellizco de dedo del dedo del día.
- Realizar la eutanasia de ratones por luxación cervical y registrar como muerto para el análisis estadístico.
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Evaluación del recuento de unidades formadoras de colonias (CFU) en órganos periféricos
- Utilice una dosis bacteriana subletal (5 x 105UFC/ratones) sobre la base de los resultados de supervivencia animal para inocular animales por el i.cist. (ver subsección 1.2).
- Controlar la temperatura rectal todos los días durante la infección y realizar anestesia de animales a 48 h después de la infección como se menciona en el paso 2.
- Proceda con la desinfección del 70% del etanol del tórax y retire 600-700 l de sangre por punción cardíaca de la cavidad torácica utilizando una aguja de 25 G 0,5 mm x 16 mm.
- Recoger la sangre en un tubo que contenga un 3,8% de citrato de sodio y almacenar a -80 oC para los recuentos de células bacterianas más tarde viables.
- Realizar dislocación cervical para sacrificar a los animales. Confirmar la muerte registrando la ausencia de latidos del corazón, después de sacrificar el ratón de acuerdo con todas las pautas institucionales y éticas relevantes.
- Coloque el ratón en la posición supina y use tijeras y fórceps para proceder con el corte del pelaje a lo largo del plano sagital del cuerpo. Fijar la piel con el pelaje en los lados del cuerpo con alfileres.
- Cortar la membrana peritoneal usando tijeras afiladas. Use tijeras y fórceps desechables para extirpar los órganos (p. ej., bazo e hígado) y ponga cada uno de ellos en un plato estéril de Petri con 1 ml de caldo GC complementado con 10% (vol/vol) glicerol.
- Deseche el cuerpo del ratón de forma segura según las directrices de la IACUC.
- Homogeneizar los órganos mecánicamente a temperatura ambiente con el émbolo de una jeringa de 5 ml durante unos 2-3 minutos hasta que se forme una suspensión de una sola célula y transferirla en un tubo.
- Coloque el tubo con la muestra de tejido homogeneizado inmediatamente sobre el hielo seco.
NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -80 oC en un tubo estéril de 2 ml para realizar la evaluación de recuentos de células bacterianas viables en puntos posteriores. - Haga placas de agar GC con antibióticos cuando sea necesario. Secar las placas antes de su uso preincubando a 37oC durante 2-3 h.
- Preparar 10 diluciones seriales de las muestras en caldo GC de cada tejido homogeneizado y placa en placas de agar GC. Incubar durante la noche a 37oC con 5% deCO2.
3. Preparación de los tejidos cerebrales para el recuento de UFC
- Utilice una dosis bacteriana subletal (5 x 105 UFC/ratones) sobre la base de los resultados de supervivencia animal para inocular animales por el i.cist. (ver subsección 1.2).
- Realizar anestesia de animales en el tiempo de infección establecido como se menciona en el paso 2.
- Realizar la eutanasia de los animales por luxación cervical.
- Limpie el área quirúrgica con 70% de etanol.
- Corta la cabeza del ratón con unas tijeras grandes.
- Resecíe el pelaje y la piel con la ayuda de pequeñas tijeras quirúrgicas y un fórceps de acero con punta fina, procediendo hacia la parte superior del cráneo para poder ver claramente las suturas y guiar la apertura del cráneo.
- Inserte la punta de una sintisa tijera a través del foramen magnum para abrir el cráneo.
- Cortar hacia el centro del cráneo y a través de la línea media del hueso parietal hacia el lado opuesto del cráneo. Corte suavemente a lo largo del borde lateral de la sutura lambdoid.
- Levante el cráneo comenzando desde la esquina parietal posterior y tire de él diagonalmente hacia arriba para descubrir el cerebro, mediante el uso de fórceps con punta fina.
- Asegúrese de que el tejido cerebral no esté unido a ningún hueso de la cabeza, cuando se levante el cráneo.
- Use fórceps desechables para extraer cualquier tejido conectivo entre el cráneo y el cerebro, para asegurarse de que el tejido cerebral se extraiga junto con el cráneo.
- No permita que el tejido cerebral se seque demasiado. Coloque el cerebro, usando fórceps desechables, en una placa de Petri con 1 ml de caldo GC complementado con 10% (vol/vol) glicerol.
- Homogeneizar el cerebro mecánicamente con el émbolo de una jeringa de 5 ml (ver paso 2.2.9). Transfiera las muestras a un tubo estéril de 2 ml y almacene -80 oC para la evaluación posterior de recuentos de células bacterianas viables, como se describe en el paso 2.2.
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Representative Results
Supervivencia de ratones infectados con N. meningitidis tipo salvaje y cepas mutantes isogénicas.
Las cepas de Neisseria meningitidis utilizadas en estos resultados representativos son la cepa de referencia del serogrupo C 93/4286 (ET-37) y su mutante isogénico 93/4286-cssA obtenido mediante inactivación insercional del gen cssA, codificando para la UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa, que se asigna en el locus de síntesis de cápsulas25. Para evaluar el grado de virulencia de la cepa cssA-defectuosa en el modelo murino actual, se evaluó la dosis letal capaz de determinar la muerte del 50% de los animales infectados (LD50). Para ello, tres grupos de animales fueron infectados por vía intracisternal con dosis que oscilaban entre 104 y 106 UFC de la cepa de tipo silvestre 93/4286 y con dosis de cepa mutante 93/4286ocssA entre 107 y 109 CFU . Generalmente, la reducción de los parámetros clínicos (por ejemplo, peso corporal y temperatura) y el aumento de la tasa de mortalidad ocurrieron dentro de las primeras 72 h después de la infección. La DL50 para la cepa de tipo silvestre correspondió al desafío meningocócico de 104 UFC, mientras que la tasa de mortalidad con la dosis de 105 UFC fue igual al 83,4% y con 106 UFC del 100%(Figura 1A). Por el contrario, para obtener la LD50 para la cepa mutante 93/4286cssA, ha sido necesaria una dosis de 108 CFU(Figura 1B),una cantidad de 10.000 veces mayor en comparación con la cepa de tipo silvestre.
Evaluación de N. meningitidis viable CFU en los tejidos cerebrales del ratón.
Para seguir la cinética de la infección en el tejido cerebral de los animales infectados, se realizó un ensayo de curso de tiempo con tipo salvaje o cepa mutante cssA 25. Después del i.cist. inyección con 5x105 CFU de 93/4286 o 93/4286 -cepas cssA, hubo un rápido aumento de bacterias de tipo salvaje en el tejido cerebral alcanzando los números más altos en alrededor de 24 h después de la infección(Figura 2A); por el contrario, en el cerebro de los ratones desafiados con el mutante isogénico cssA-defectuoso, los recuentos viables disminuyeron progresivamente con el tiempo hasta 2.026 registro de CFU a 1.774 72 h después de la infección(Figura 2A). El experimento ha demostrado que el 33,3% de los ratones con problemas mutantes mostraron aclaramiento bacteriano del sitio de la infección, mientras que la infección por cepa de tipo salvaje nunca fue erradicada del cerebro de los animales.
Evaluación de la carga meningocócica en bazo e hígado 48h post-desafío.
Este experimento se realizó para evaluar el aclaramiento de bacterias de ratones infectados 48 h después del desafío en órganos periféricos. Con este fin, se infectaron dos grupos de ratones con 5 x 105 UFC de cepasde cssA 93/4286 o 93/4286, y se evaluaron recuentos bacterianos viables en el bazo y el hígado de ratones infectados25 (Figura 2B). Después de 48 h de la inyección meningocócica, el mutante defectuoso cssAfue completamente eliminado en bazo e hígado, mientras que los animales infectados con cepa de tipo salvaje exhibieron un marco de infección sistémica persistente. Los valores medios de la CFU después de 48 h eran, de hecho, todavía 3.212 log CFU a 3.354 y 6.949 log CFU a 1,37 en el bazo y el hígado, respectivamente. La diferencia en las cargas bacterianas en el tejido hepático de dos grupos animales fue estadísticamente significativa (con un P < 0.001).
Figura 1: Supervivencia de ratones infectados con cepas de tipo salvaje 93/4286 o cssA-defectuosoN cepas. (A) Tres grupos de ratones Balb/c (n.o 6/dosis) se infectaron i.cist. con 104, 105, y 106 CFU/ratón de la cepa de tipo salvaje 93/4286 y (B) con 107, 108y 109 CFU/ratón de la cssAisogénica -mutante defectuoso. Los ratones fueron monitoreados durante una semana, y se registró la supervivencia. Los resultados se expresan como porcentaje de supervivencia en diferentes dosis a lo largo del tiempo, el valor del rango de registro p fue < 0.05 para ratones infectados con la cepa de tipo salvaje. Esta cifra ha sido modificada de Colicchio et al.25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de las cargas bacterianas a lo largo del tiempo en ratones inoculados con las cepascssA 93/4286 o 93/4286. (A) Curso de tiempo de cargas bacterianas en los tejidos cerebrales después de i.cist. Infección. Dos grupos de ratones Balb/c (n.o 20/grupo) fueron infectados por el i.cist. ruta con 5 x 105 CFU de la cepa de tipo salvaje 93/4286 o el mutante defectuoso cssA. Los animales fueron sacrificados 4, 24, 48 y 72 h después de la infección. Los cerebros fueron cosechados, homogeneizados mecánicamente en medio GC, y se determinaron recuentos viables. Los resultados se expresan como la media del registro DeSC de los números de CFU por órgano en diferentes momentos después de la inoculación. Los asteriscos indican significación estadística (**, P < 0.01). (B) Cargas bacterianas con el tiempo en bazo e hígado. Dos grupos de ratones Balb/c (n a 5/grupo) fueron infectados i.cist. con 5 x 105 CFU de la cepa de tipo salvaje 93/4286 o el mutante defectuoso cssA. Los animales fueron eutanasiados 48 h después de la infección. Se cosecharon bazos e hígados, se homogeneizaron mecánicamente y se determinaron recuentos viables. Los resultados se expresan como números de CFU de registro por órgano. Las barras horizontales indican troncos medios de tetas bacterianas. Los asteriscos indican significación estadística (***, P < 0.001). Esta cifra ha sido modificada de Colicchio et al.25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, describimos un protocolo experimental para inducir la meningitis meningocócica en ratones adultos por i.cist. inoculación de bacterias meningocócicas. Hasta nuestro conocimiento, no se ha desarrollado ningún otro modelo de meningitis meningocócica en ratones de laboratorio infectados por i.cist. ruta; en el pasado, esta forma ha sido explorada para proporcionar modelos de meningitis meningocócica tanto en rata31 como en conejo32. Es bien sabido que la tasa más alta de enfermedad meningocócica se encuentra entre niños pequeños, adolescentes y adultos jóvenes33,34,35; por esta razón, en nuestro modelo de ratón por meningitis, en lugar de centrarse en animales neonatales o infantiles, se emplearon animales inmunocompetentes de 8 semanas de edad.
En nuestro modelo experimental, decidimos usar i.cist. inóculo ya que asegura la liberación de los meningococos directamente en cisterna magna facilitando así la replicación bacteriana en el FSE. Esta vía de inoculación es fisiológicamente más accesible28 y menos traumática que la vía suabarnoidal intracraneal, ya utilizada para el desarrollo de la meningitis debido a Streptococcus spp. 36,37. Aunque no representa la forma natural de infección del meningococo, la inyección de bacterias en esta área fue fundamental para la inducción de la meningitis meningocócica, como lo demuestra la supervivencia del ratón, las cargas bacterianas, los parámetros clínicos, y también por Análisis histológico24,25,26. Curiosamente, cepa de referencia 93/4286 inducida por meningitis con rasgos histopatológicos imitando a los observados en la enfermedad humana24,25,26.
Para establecer una infección murina estandarizada y garantizar la seguridad de los investigadores, se prefirió partir de un stock de bacterias congeladas valoradas en lugar de un crecimiento bacteriano fresco24,25,30, 38, además, decidimos utilizar una dosis subletal de meningococos vivos con el objetivo de limitar un rápido desenlace fatal y permitir el desarrollo de daño cerebral2,24,25,26. Sin embargo, para determinar una dosis infecciosa adecuada para diferentes cepas, se deben realizar experimentos preliminares. En el presente estudio, probamos una cepa de referencia del serogrupo C 93/4286 y una cepa mutante isogénica 93/4286scssA con una dosis de 5 x 105 CFU/ ratones.
Aunque este modelo no imita las fases iniciales de la colonización y la invasión del meningococo, el aislado bacteriano crece bien no sólo en el LCR, sino que también es capaz de permanecer en los compartimentos del bazo y del hígado. Durante la fase hipoferremica de la infección neisserial, la mayor parte del hierro derivado del hemo permanece combinado con ferritina hepática. Como la ferritina se puede utilizar meningococos para obtener hierro39, el hígado constituye un órgano diana para la replicación bacteriana.
En este procedimiento experimental, la cepa de ratón endogámica Balb/c se utilizó en la sustitución de la cepa CD-1 de raza que se empleó originalmente para desarrollar la meningitis meningocócica modelo24. Los ratones de raza se caracterizaron por una amplia variabilidad genética que puede ser más apropiada para revelar varios efectos en una cohorte variable como la población humana40,41. Sin embargo, esta variabilidad necesita un tamaño de muestra más alto para obtener suficiente significación estadística y puede interferir con la estandarización de procedimientos y estudios específicos.
A pesar de la estrecha gama de meningococos, para asegurar la replicación de bacterias en el huésped murino y mejorar la virulencia de los meningococos, se administró devoción de hierro a los animales antes de la infección6,14. Por último, en comparación con otro modelo experimental de meningitis, los animales no fueron tratados con antibióticos, para no afectar el curso de la enfermedad y/o el perfil de la respuesta inflamatoria26.
Hasta la fecha, nuestros estudios han puesto de relieve que el i.cist. modelo es funcional para inducir tanto la meningitis como la enfermedad meningocócica invasiva en comparación con los modelos de infección i.p. o i.n., que se caracterizan por la aparición de sepsis y bacteriemia antes de que se establezca la meningitis10,11 ,12,13,14,15,16,17. Por lo tanto, este modelo de infección basado en la inducción de la meningitis en el huésped murino, podría ser útil no sólo para evaluar la estrategia terapéutica innovadora para prevenir la replicación bacteriana directamente en el LSC, sino también para analizar la eficacia de un posible inmune pasivo contra patógenos humanos.
Sin embargo, la infección meningocócica es un proceso de varios pasos, que incluye la colonización de la nasofaringe, el acceso al torrente sanguíneo, el cruce de la barrera hematoencefálica y finalmente la proliferación incontrolada en el LCR, nuestro modelo sólo reproduce algunos aspectos de la infección meningocócica, con el fin de subvertir en parte estas limitaciones modelo animal transgénico puede ser útil para imitar la patogénesis humana de la enfermedad meningocócica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los estudios fueron apoyados en parte por PRIN 2012 [número de subvención 2012WJSX8K]: "Modelos de interacción Host-microbe en infecciones mucosas: desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas" y por PRIN 2017 [2017SFBFER]: "Un enfoque integrado para abordar la interacción entre condiciones estresantes y resistencia a los antimicrobianos de patógenos desafiantes".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
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