生物样品中赤子酶活性的测定
Summary
这里介绍的是一种测量脑油中齐辛酶活性的简单方法，如支气管活原或血清。
Abstract
奇他酶是裂解奇他素的酶。即使在没有皮他当，哺乳动物体内（包括基线）中也有大量的皮塔那色。钱他酶的确切作用尚不清楚，但据信它在消化和宿主防御含奇他成的食物和病原体方面分别起着重要作用。最近的工作，包括我们的，已经表明了齐辛酶和齐齐酸酶样蛋白在宿主免疫和过敏性疾病中的重要作用。重要的是，Chitinase活动是疾病严重性的重要生物标志物，包括哮喘和肺纤维化等2型炎症性疾病。同样，像高彻病这样的遗传性疾病患者的齐齐纳酶水平显著升高，这不仅与疾病严重程度相关，而且作为治疗效果的可靠生物标志物。此处概述的协议描述了一种简单、快速和直接的方法，用于测量小鼠 BAL 或血清样本中的齐辛酶活性，并且由于酶的高度保守性，可以广泛地适应人类受试者和其他模型生物体。
Introduction
奇青素是地球上仅次于纤维素的第二大多糖，是各种生物的主要结构成分，包括昆虫、真菌、酵母和藻类的外骨骼;一些脊椎动物也有奇丁1。奇西纳酶是一个酶家族，能够分解奇丁，并在从细菌到哺乳动物2、3等物种的进化过程中高度保存。除了奇他酶，哺乳动物也有丘蒂酸酶样的蛋白质，这些蛋白质在结合奇他素的能力上与奇它酶相似，但不同的是，它们缺乏酶能力来切切奇他4。
尽管奇他和奇它原体早已被研究——调查可追溯到20世纪初——但主要焦点一直是它们在昆虫和其他无脊椎动物中的作用。事实上，直到20世纪60年代，脊椎动物才被发现有丘台动物。使用基于甲苯的测定法，在包括蜥蜴和黑鸟在内的许多脊椎动物的消化道中发现了甲子酶，据推测，这种观察是由于食用了含甲氧基的有机体，如昆虫5.
哺乳动物有两种酶活性形式的甲酸酶：酸性哺乳动物甲壳酶（AMCase;也称为CHIT2和CHIA）和甲基锡酶（CHIT1）4。这两种蛋白质都能够水解奇他蛋白。然而，CHIT1在人类中更具有酶活性，几乎所有齐齐辛酶活性都来自CHIT1。4在小鼠中，Chit1和AMCase几乎同样地对整个齐齐辛酶活性6作出贡献。另一方面，齐齐那酶样蛋白质缺乏齐齐那酶活性。
Chit1主要通过巨噬细胞分泌，通常被认为是对含甲苯的病原体7的免疫反应。该酶也已被证明参与单核细胞成熟到M1和M2巨噬细胞亚型，即使没有基质甲肽8的存在。此外，它也可能涉及其他免疫细胞的成熟，包括T帮助器2型（Th2）细胞和嗜酸性粒细胞-如在隐球菌肺感染9中证明的情况。这些研究指出，奇塔因斯系统在免疫系统中有着复杂的作用。
近年来，Chit1水平被发现是40多种人类疾病的重要生物标志物，包括体球储存疾病、传染病、呼吸系统疾病、内分泌疾病、心血管疾病、神经系统疾病和其他疾病（第10页）。在许多这些疾病中，Chit1水平是疾病严重程度和治疗效果的有力预测。
由于奇质酶已经获得了作为包括高彻病等多种疾病的生物标志物的声誉，因此开发了工具和检测方法，以方便对奇他打酶的存在进行检测。较旧的方法包括沙勒斯的程序、根据血糖测试改编的方案以及 3，5 二硝基水杨酸 （DNS） 方法。然而，这些方法往往是时间敏感和技术上困难11。这两种测试的程序要求减少无机氧化剂，例如，在沙勒程序的情况下，铁氧体化物，产生一种颜色变化，只能分光光度测量。此外，这两个测试都涉及加热或沸腾步骤，既耗时又需要颜色开发12，13。
这里描述的是一种快速而简单的荧光测定，以确定哺乳动物样本14、15中的齐辛酶水平。此处使用的两个样本包括血清和支气管输液洗浴液 （BAL）;在母乳和尿液样本中也测量了齐辛酶活性，该技术可以在这些类型的样品以及任何其他生物液体16、17中进行。
Protocol
Representative Results
Discussion
赤子酶活性已成为预测疾病严重性、疾病进展、治疗效果和特定病原体存在的重要生物标志物18。虽然许多关于齐替酶作用的长期假设理论尚未经过实验证实，但新的研究为奇它酶和齐齐那酶等蛋白质在各种疾病中的作用提供了重要的见解2， 9，20.
此处描述的方案是测?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了美国肺脏协会和美国胸腔学会对LS的奖项的支持。作者衷心感谢杰克·埃利亚斯博士和李春根博士提供转基因小鼠菌株。
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
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