Meting van Chitinase activiteit in biologische monsters

Summary

Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode voor het meten van Chitinase activiteit in biologische vloeistoffen zoals bronchoalveolaire spoeling of serum.

Abstract

Chitinasen zijn de enzymen die het aankleven van chitin. Zelfs bij afwezigheid van chitine hebben zoogdieren aanzienlijke hoeveelheden chitinases aanwezig in het lichaam, waaronder bij Baseline. De precieze rol van Chitinase is niet bekend, maar het werd verondersteld om een belangrijke rol te spelen in de spijsvertering en gastheer verdediging tegen chitin-bevattende voedsel en pathogenen, respectievelijk. Recent werk, met inbegrip van de onze, heeft een belangrijke rol getoond van Chitinase en Chitinase-achtige eiwitten in gastheer immuniteit en allergische ziekten. Belangrijk, Chitinase activiteiten dienen als belangrijke biomarkers van de ernst van de ziekte in een breed scala van ziekten, met inbegrip van type 2 ontstekingsziekten zoals astma en pulmonale fibrose. Evenzo hebben patiënten met genetische aandoeningen zoals de ziekte van Gaucher de Chitinase-niveaus significant verhoogd, die niet alleen correleren met de ernst van de ziekte, maar ook dienen als een betrouwbare biomarker voor therapeutische effectiviteit. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een eenvoudige, snelle en eenvoudige manier om Chitinase-activiteit in BAL-of serummonsters van muizen te meten en kan op grote schaal worden aangepast aan menselijke proefpersonen en andere model organismen als gevolg van de sterk geconmaelde aard van de enzymen.

Introduction

Chitine is de op een na meest overvloedige polysaccharide op aarde na cellulose en fungeert als een belangrijke structurele component van een verscheidenheid aan organismen, waaronder het exoskelet van insecten, schimmels, gist en algen; Sommige gewervelde dieren hebben ook chitine¹. Chitinases zijn een familie van enzymen die in staat zijn chitine af te breken en worden sterk geconconserd door de evolutie in soorten variërend van bacteriën tot zoogdieren^2,3. Naast chitinases hebben zoogdieren ook Chitinase-achtige eiwitten die vergelijkbaar zijn met chitinases in hun vermogen om chitine te binden, maar verschillen in die zin dat ze het enzymatische vermogen missen om de chitine⁴te klieven.

Hoewel chitine en chitinases al lang bestudeerd zijn — met onderzoeken die dateren uit de vroege jaren 1900 — lag de nadruk op hun rol in insecten en andere ongewervelde dieren. In feite was het pas in de jaren zestig, toen gewervelde dieren in het geheel chitinases bleken te hebben. Met behulp van een op chitobiase gebaseerde assay bleken chitinases te worden gevonden in het spijsverteringskanaal van een aantal gewervelde dieren, waaronder hagedissen en Merel — een observatie veronderstelde te wijten aan het gebruik van chitine bevattende organismen zoals insecten⁵ .

Zoogdieren hebben twee enzymatisch actieve vormen van Chitinase: zure zoogdier Chitinase (AMCase; ook bekend als CHIT2 en CHIA) en chitotriosidase (CHIT1)⁴. Beide eiwitten zijn geschikt voor het hydrolyseren van chitine. Echter, CHIT1 is meer enzymatisch actief bij de mens, waar bijna alle Chitinase activiteit is afgeleid van CHIT1. ⁴ bij muizen dragen zowel Chit1 als amcase bijna evenveel bij aan de algehele activiteit van Chitinase⁶. Aan de andere kant, Chitinase-achtige eiwitten missen Chitinase activiteit.

Chit1 wordt voornamelijk uitgescheiden door macrofagen en wordt vaak beschouwd als een immuunrespons op chitine bevattende pathogenen⁷. Het enzym is ook betrokken bij de rijping van monocyten in zowel M1 en m2 macrofaag subtypen, zelfs zonder de aanwezigheid van het substraat chitine⁸. Bovendien, het kan ook worden betrokken bij de rijping van andere immuuncellen, met inbegrip van T helper type 2 (Th2) cellen en eosinofielen — zoals bleek het geval te zijn in crypto Kokken longinfectie⁹. Deze studies wijzen op een complexe rol van chitinases in het immuunsysteem.

In de afgelopen jaren, Chit1 niveaus zijn gevonden om te dienen als een belangrijke biomarker van progressie voor meer dan 40 verschillende ziekten van de mens, met inbegrip van lysosomale opslag ziekten, infectieziekten, ademhalingsziekten, endocrinologische ziekten, cardiovasculaire ziekten, neurologische aandoeningen, en anderen (beoordeeld¹⁰). In veel van deze ziekten, de niveaus van Chit1 zijn een sterke voorspeller van de ernst van de ziekte en therapeutische effectiviteit¹⁰.

Omdat chitinases een reputatie hebben opgebouwd als biomarker voor talrijke medische aandoeningen, waaronder de ziekte van Gaucher, zijn gereedschappen en assays ontwikkeld om het testen van de aanwezigheid van Chitinase te vergemakkelijken. Oudere methoden zijn onder meer de procedure van Schales, een protocol dat is aangepast aan een bloedglucose test en de methode met 3, 5 dinitrosalicyl zuur (DNS). Echter, deze methoden zijn vaak tijd gevoelig en technisch moeilijk¹¹. De procedure voor beide tests vereist de reductie van anorganische oxidanten, ferricyanide in het geval van de Schales-procedure, bijvoorbeeld het produceren van een kleurverandering die alleen spectrofotometrisch kan worden gemeten. Daarnaast hebben beide tests betrekking op een verwarmings-of kook stap die zowel tijdrovend als noodzakelijk is om de kleur^12,13te ontwikkelen.

Hier beschreven is een snelle en eenvoudige fluorimetrische assay om de Chitinase spiegels in zoogdier monsters^14,15te bepalen. Twee van de hier gebruikte monsters omvatten serum en bronchoalveolaire spoeling vloeistoffen (bal); Chitinase activiteit is ook gemeten in moedermelk en urine monsters, en de techniek kan worden uitgevoerd in dit soort monsters, alsmede in elke andere biologische vloeistof^16,17.

Protocol

Alle dier procedures werden uitgevoerd onder een IACUC-goedgekeurd protocol aan de Yale University School of Medicine. 1. voorbeeld verzameling van muizen Esthetisering Anesthetiseer muizen met ketamine en xylazine (100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine). Bloedmonster collectie Bevestig de diepte van de anesthesie door niet-responsiviteit op een teen knijpen. Open de borstholte chirurgisch om …

Representative Results

De getoonde resultaten zijn afkomstig uit een studie die de Chitinase activiteit in serum en BAL monsters van wild type (C57BL/6) en Chit1 transgene muizen (op C57BL/6 achtergrond) meet die het Chit1 gen op een doxycycline-promotor overdrukken. Uit onze gegevens blijkt dat zowel serum-als BAL monsters detecteerbare Chitinase-activiteit hebben bij Baseline 698,2 ± 189,9 nmol/mL · h en 485,7 ± 114 nmol/ml · h, respectievelijk. Overexpressie van het Chit1 gen met behulp van doxycycline in drinkwater gedurende 4 weken re…

Discussion

Chitinase activiteit is ontstaan als een belangrijke biomarker voor het voorspellen van de ernst van de ziekte, ziekteprogressie, therapeutische effectiviteit en de aanwezigheid van specifieke pathogenen¹⁸. Hoewel veel van de lang gepostleerde theorieën over de rol van chitinases niet experimenteel zijn bewezen¹⁹, hebben nieuwe studies belangrijke inzichten gegeven in de rol van chitinasen en Chitinase zoals eiwitten in verschillende ziekten^{2, …}

Materials

4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224