생물학적 샘플에서 치티나제 활성 측정
Summary
여기에 제시된 기관지 충혈 충혈 또는 혈청과 같은 생물학적 유체에서 치티나제 활성을 측정하는 간단한 방법이 있다.
Abstract
치티나제는 치틴을 갈라주는 효소입니다. 키틴이 없는 경우에도 포유류는 기준선을 포함하여 신체에 존재하는 상당한 양의 키티나아제가 있습니다. 키티나아제의 정확한 역할은 알려져 있지 않지만, 각각 키틴 함유 음식과 병원균에 대한 소화 및 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨졌다. 최근 우리 들을 포함 하 여, 숙 주 면역 및 알레르기 성 질환에 치 티 나 제와 치 티 나 제 같은 단백질의 중요 한 역할을 보이고 있다. 중요한 것은, 치티나제 활동은 천식 과 폐 섬유증과 같은 타입-2 염증성 질병을 포함하여 질병의 넓은 범위에 있는 질병 엄격의 중요한 biomarkers로 봉사합니다. 유사하게, Gaucher 질병 같이 유전 무질서를 가진 환자는 질병 엄격과 상관되는 뿐 아니라 치료 효과를 위한 믿을 수 있는 biomarker로 봉사하는 치티나제 수준을 현저하게 상승했습니다. 여기에서 설명된 프로토콜은 쥐의 BAL 또는 혈청 샘플에서 치티나제 활성을 측정하는 간단하고 빠르며 간단한 방법을 설명하며 효소의 고도로 보존된 특성으로 인해 인간 대상자 및 기타 모델 유기체에 널리 적응될 수 있습니다.
Introduction
키틴은 셀룰로오스 에 이어 지구상에서 두 번째로 가장 풍부한 다당류이며, 곤충, 곰팡이, 효모 및 조류의 외골격을 포함한 다양한 유기체의 주요 구조 성분으로 서용; 일부 척추 동물은 또한 치틴1. 치티나제는 치틴을 분해할 수 있는 효소의 가족이며 박테리아에서 포유류에 이르는 종의 진화를통해 매우 보존되어 2,3. 키티나제 이외에, 포유동물은 또한 키틴을 결합하는 그들의 기능에 있는 키티나아제와 유사하지만 키틴 4를 갈라는 효소 능력이 부족하다는 점에서다릅니다 chitinase 같이 단백질이 있습니다.
1900년대 초로 거슬러 올라가는 조사와 함께 치틴과 치티나제는 오랫동안 연구되어 왔지만, 곤충과 다른 무척추 동물에서 그들의 역할에 중점을 두었습니다. 사실, 척추동물이 치티나제를 전혀 가지고 있는 것으로 밝혀진 1960년대까지는 아니었습니다. 키토비아제 기반 분석기를 사용하여, 키티나제는 도마뱀과 흑새를 포함한 다수의 척추동물의 소화관에서 발견되는 것으로 나타났는데, 이는 곤충과 같은 키틴 함유 유기체의 소비로 인한 것으로 추정되는관찰5 .
포유류는 치티나아제의 두 가지 효소 활성 형태를 가지고 있습니다: 산성 포유류 치티나아제 (AMCase; CHIT2 및 CHIA로도알려져 있음) 및 키토트리오시다제 (CHIT1) 4. 이 단백질의 둘 다 가을 분해 하는 치 틴 수 있습니다. 그러나, CHIT1은 거의 모든 치티나아제 활성이 CHIT1에서 파생되는 인간에서 더 효소적으로 활동적입니다. 4 마우스에서, 치트1과 AMCase 둘 다 거의 동등하게 전반적인 치티나제 활성에 기여6. 다른 한편으로는, 치티나제 같이 단백질은 치티나제 활동이 부족합니다.
Chit1은 주로 대식세포에 의해 분비되며 종종 치틴 함유 병원체 7에대한 면역 반응으로 간주됩니다. 효소는 또한 기질 키틴8의존재 없이도 M1 및 M2 대식세포 아류형 둘 다로 단핵구의 성숙에 관여하는 것으로 나타났다. 더욱이, 또한, T 도우미 타입 2(Th2) 세포 및 호산구를 포함하는 다른 면역 세포의 성숙에 관여할 수 있다-크립토코칼 폐감염의경우9로 나타났다. 이 연구 결과는 면역 계통에 있는 chitinases의 복잡한 역할을 가리킵니다.
최근, Chit1 수준은 리소좀 저장 질환, 전염병, 호흡기 질환, 내분비학 질환, 심혈관 을 포함한 40 가지 이상의 인간 질병에 대한 진행의 중요한 바이오 마커역할을하는 것으로 밝혀졌다. 질병, 신경 질환 및 기타(검토 10). 이러한 질병의 많은, Chit1의 수준은 질병 심각도 및 치료 효과의 강력한 예측자10.
키티나제는 고셔 병을 포함한 수많은 의료 조건에 대한 바이오마커로 명성을 얻었기 때문에, 키티나제 존재에 대한 테스트를 용이하게 하기 위해 도구와 분석이 개발되었습니다. 이전 방법에는 Schales의 절차, 혈액 포도당 검사에서 적응된 프로토콜 및 3,5 dinitrosalicyliclicacid (DNS) 방법이 포함됩니다. 그러나, 이러한 방법은 종종 시간에 민감하고 기술적으로 어려운11. 이 두 시험에 대한 절차는 예를 들어 Schales의 절차의 경우 무기 산화제, 페리시아니드의 감소를 필요로하며, 분광광측정으로만 측정될 수 있는 색상 변화를 생성합니다. 부가적으로, 두 시험은12,13을개발하는 데 시간이 많이 걸리고 필요한 가열 또는 비등 단계를 포함한다.
여기서 기재된 포유동물 샘플 에서 치티나아제 수준을 결정하는 빠르고 간단한 형광 분석법(14,15). 여기에서 사용된 견본의 2개는 혈청 및 기관지 정맥 세척 액체 (BAL)를 포함합니다; 치티나아제 활성은 또한 모유 및 소변 샘플에서 측정되었으며, 기술은 다른 생물학적 유체16,17뿐만아니라 이러한 유형의 샘플에서 수행될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
치티나아제 활성은 질병 중증도, 질병 진행, 치료 효과 및 특정 병원체의존재를 예측하기 위한 중요한 바이오마커로서 18로 나타났다. 키티나아제의 역할에 대한 많은 이론이 실험적으로 입증되지 는 않았지만19,새로운 연구는 다양한 질병의 단백질과 같은 키티나제와 치티나아제의 역할에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다2, <sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 LS에 미국 폐 협회와 미국 흉부 학회 상에 의해 지원되었다. 저자는 진심으로 박사 잭 엘리아스와 이춘근 박사에게 형질전환 마우스 균주를 제공해 준 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
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