نحن نصف طريقة في الجسم الحي للتحقيق في فقدان وظيفي لجين معين في الخلايا الساتلية باستخدام مزيج من إصابة القلب بوساطة من العضلات الهيكلية وحقن siRNA ذاتية التسليم.
العضلات الهيكلية تمتلك قدرة هائلة على تجديد بعد الإصابة. والدافع الرئيسي لهذه العملية من الخلايا الجذعية العضلات، وتسمى أيضا الخلايا الساتلية. وتتميز الخلايا الساتلية بالتعبير عن عامل النسخ Pax7 وموقعها تحت اللامينا القاعدية في العضلات الهيكلية يستريح. عند الإصابة، يتم تنشيط الخلايا الساتلية، والخضوع للتجديد الذاتي أو التمايز إما لتشكيل myofibers جديدة أو لصهر مع تلك التالفة. يمكن التحقيق في وظائف الخلايا الساتلية في الجسم الحي باستخدام نموذج إصابة القلب والسم القائم على العضلات الهيكلية. لدراسة وظيفة جين واحد أثناء تجديد العضلات الهيكلية، وتستخدم في الغالب نماذج الماوس المعدلة وراثيا. هنا، نقدم طريقة بديلة للفئران المعدلة وراثيا، للتحقيق في وظيفة الجينات في الخلايا الساتلية أثناء التجدد، على سبيل المثال، في الحالات التي لا تتوفر فيها الفئران المعدلة وراثيا. نحن الجمع بين إصابة القلب بوساطة من العضلات الهيكلية محددة مع حقن siRNA ذاتية التسليم في العضلات المجددة التي يتم تناولها بعد ذلك من قبل الخلايا الساتلية بين الخلايا الأخرى. وبالتالي، نحن نقدم طريقة لتحليل وظيفة الجينات في الخلايا الساتلية أثناء التجدد في ظل الظروف الفسيولوجية دون الحاجة إلى الفئران المعدلة وراثيا.
العضلات الهيكلية هي أكبر أنسجة الجسم التي تمثل ما يقرب من 40٪ من إجمالي وزن الجسم تمكين الحركة الطوعية. تتكون بنية الأنسجة من العضلات الهيكلية أساسا من ما بعد الأنسجة، المتمايزة بشكل نهائي، myofibers multinucleated، فضلا عن مختلف الخلايا الأخرى من الجهاز العصبي المحيطي، ونظام الأوعية الدموية، والخلايا الخلالية1. الأهم من ذلك، العضلات الهيكلية لديها قدرة هائلة على تجديد واستعادة وظيفة عند الإصابة أو الضرر2. هذه العملية تعتمد على الخلايا الجذعية العضلات المقيمة في الأنسجة وتسمى أيضا الخلايا الساتلية3،4. وتقع الخلايا الساتلية بين myofiber واللامينا القاعدية وتتميز بالتعبير عن عامل النسخ Pax75و6و7. في ظل الظروف المثلية ، تكون الخلايا الساتلية هادئة ولكن يتم تفعيلها بسبب الإصابة الصادمة ، على سبيل المثال ، من خلال ممارسة غريب الأطوار أو تجريبيا من خلال حقن سم الأفعى والسم القلبي6،8. بمجرد تفعيلها، وPax7 خلايا الأقمار الصناعية الإيجابية تشارك في التعبير عن MyoD وMyf5، الذي يلزم الخلايا الجذعية إلى التمايز myogenic. وستحتفظ الخلايا الساتلية التي تقاوم رفع تنظيم عوامل الالتزام بإمكاناتها الجذعية وتعود إلى الارتجاف لتجديد مجمع الخلايا الجذعية لتلبية الطلبات في المستقبل. بعد توسيع تجمع الذرية المسببة للسرطان، يتم تنشيط الشبكات النسخية من قبل عوامل التمايز مثل Myogenin لبدء خروج دورة الخلية والتمايز النهائي. هذه myoprogenitors ثم الصمامات إلى بعضها البعض أو إلى myofibers القائمة المساهمة myonuclei للحفاظ على حجم المجال النووي الماينوالنووي. ال [موفيبرس] عبّر عن انتهائيّة عضلة تمايز مورثات مثل [موسين] سلسلة ثقيلة. وأخيرا، myofibers شكلت حديثا تنمو وناضجة لبناء وحدات وظيفية من العضلات الهيكلية9،10.
تجديد العضلات الهيكلية يمكن أن تتأثر بظروف مختلفة بما في ذلك أمراض العضلات أو الشيخوخة11،12، بدءا من العاهات خفيفة لظروف تهدد الحياة ، على سبيل المثال ، في ضمور العضلات دوشين13 , 14.ولذلك، يهدف الطب التجديدي إلى استعادة أنسجة العضلات الهيكلية التالفة أو المعطلة باستخدام قوتها التجديدية المتأصلة من خلال استهداف وظيفة الخلية الساتلية15،16. ولاستخدام إمكاناتها الكاملة، يلزم فهم شامل للخلايا الساتلية في مكانتها الذاتية أثناء تجديد العضلات الهيكلية. وعلى الرغم من وجود نُهُج تجريبية لعزل الخلايا الساتلية المجاورة لـ myofibers17،فإن التعقيد الكامل للتفاعلات الخلوية والنظامية للخلايا الساتلية مع بيئتها لا يمكن تلخيصه إلا في الجسم الحي. في هذا الصدد، تم الحصول على معرفة كبيرة حول تجديد العضلات والهيكل العظمي باستخدام نماذج إصابة الماوس2،18.
هنا نقدم نموذج إصابة الماوس التجريبية محددة لدراسة الخلايا الجذعية بوساطة تجديد الأضرار الناجمة عن السموم القلبية من العضلات الأمامية tibialis في الجسم الحي. يتم حقن السموم القلبية، وهي مادة سامة مقوسة مشتقة من الأفعى تسبب إزالة الاستقطاب والنخر في عضلة الساقية الأمامية، والتي بدورها سوف تؤدي إلى انحطاط الأنسجة متبوعاً بالتجدد. لتحليل وظيفة الجينات أثناء التجدد الحاد، يتم حقن siRNAs ذاتية التسليم في اليوم 3 بعد الإصابة، في ذروة توسع الخلايا الساتلية. يتم التضحية الحيوانات التجريبية في نقاط زمنية مختلفة ويتم جمع العضلات الأمامية tibialis. يتم تجميد العضلات تشريح ومعالجتها لمزيد من التبريد. ثم يتم استخدام الفحص المجهري المناعي لتحليل علامات التجديد. تسمح هذه الطريقة للتحقيق في وظيفة جين واحد أثناء تجديد الخلايا الفضائية مدفوعة من العضلات الهيكلية باستخدام الفئران من النوع البري.
هنا نقدم طريقة للتحقيق في وظيفة جين معين أثناء تجديد العضلات الهيكلية دون الحاجة إلى الحيوانات المعدلة وراثيا. ويتم ذلك من خلال الجمع بين إصابة العضلات الناجمة عن القلب السم مع حقن siRNA ذاتية التسليم في العضلات الهيكلية المجددة في اليوم 3 بعد الإصابة. لقد وصفنا بالتفصيل إجراءات إصابة العضلات عن طريق السموم القلبية، وحقن siRNA ذاتية التسليم ومعالجة العضلات التي تم حصادها لتحليل تقدم التجديد. نثبت أن حقن سم الأفعى في العضلات الهيكلية يصيب العضلات بأكملها بشكل فعال، وأنه تم العثور على siRNAs ذاتية التسليم في حوالي 75٪ من جميع الخلايا الساتلية من بين أنواع الخلايا الأخرى بعد يومين من حقنها في تجديد العضلات الهيكلية(الشكل 4، الشكل 5).
وينبغي تركيز اهتمام خاص على إصابة متجانسة من العضلات الأمامية tibialis منذ درجات متفاوتة من الإصابة تؤثر على نتيجة التجديد وبالتالي أيضا تأثير siRNA قد تتأثر. وعلاوة على ذلك، من الأهمية بمكان أن يتم حقن منطقة التجديد بأكملها مع سيرنا ذاتية التسليم. لتحليل عملية التجديد، فمن المستحسن أن تقارن دائما مناطق مماثلة من العضلات الهيكلية المجددة، وبالتالي، ينبغي قطع العضلات الأمامية tibialis في النصف لمقارنة دائما منطقة منتصف البطن من العضلات. عند تحليل العضلات، يحتاج استئصال التبريد بأكمله إلى تحليل لأن تكوين myofiber يختلف في العضلات الأمامية tibialis، وبالتالي قد تجدد بشكل مختلف.
وظيفة الخلايا الساتلية يمكن التحقيق فيها من خلال إجراءات تجريبية مختلفة بما في ذلك ثقافتها على myofibers واحدة معزولة المجاورة17، عن طريق زرع وتحليل تجديد العضلات الهيكلية بعد الإصابة المستحثة 18،19. التحقيق في وظيفة الخلايا الساتلية باستخدام نموذج الإصابة المستحثة في الجسم الحي، على سبيل المثال، حقن السموم القلبية، يوفر القدرة على تحليل وظيفة الخلايا الساتلية أيضا من حيث تفاعلها مع أنواع الخلايا الأخرى مثل الضامة و التحقيق في تأثير العوامل النظامية2. يمكن تحقيق إصابة العضلات الهيكلية بوسائل مختلفة، على سبيل المثال، ممارسة غريب الأطوار، وإصابة التجميد، وحقن BaCl2 أو حقن سم الأفعى مثل سم القلب أو notexin18. في حين أن ممارسة غريب الأطوار هو على الارجح طريقة الإصابة الأكثر فسيولوجية، وإصابة عضلة واحدة معينة محدودة فقط20. ويمكن تطبيق إصابات التجميد عندما تكون هجرة الخلايا الساتلية نحو موقع الإصابة هي الهدف من الدراسة أو ينبغي إصابة جزء محدد فقط من العضلات. من الناحية التجريبية العيب من إصابات التجميد هو الجراحة المفتوحة التي تحتاج إلى إجراء لتطبيق التحقيق المعدني المبردة مسبقا. حقن BaCl2 أو سم الأفعى هو الأسلوب الأكثر دراماتيكية للإصابة، وبالتالي تحدي وظيفة الخلية الفضائية أكثر من غيرها. وعلاوة على ذلك، فإن الحقن طفيف التوغل، ووقت الجراحة، بشكل عام، هو أقل من خمس دقائق ولا ينطوي على الخياطة، وما إلى ذلك مما يقلل من خطر العدوى.
وتستخدم إصابة العضلات في الغالب للتحقيق في العواقب الوظيفية لفقدان وظائف الجينات، على سبيل المثال، فقدان Pax77،21. خاصة إذا كانت الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين هي محور المسألة العلمية، وتوليد أو استخدام الفئران المعدلة وراثيا في كثير من الأحيان غير ممكن. حقن siRNAs ذاتية الإيصال التي تستهدف جين معين هو بديل قابل للتطبيق في تلك الحالات، وقد استخدمت بنجاح22. وباختصار، أصيب في اليوم الثالث من الإصابة بالعضلات الأمامية للفئران، تم حقن عضلة الساقية الأمامية عن طريق حقن سموم القلب وsiRNAs ذاتية التسليم الموجهة ضد الفيبرونيكتين (FN). تم تحليل العضلات بعد 10 أيام من الإصابة ولوحظ انخفاض كبير في أرقام الخلايا الفضائية في siFN مقابل شروط التحكم siRNA المخفوقة. تم تحديد كفاءة الضربة القاضية في lysates العضلات كلها من قبل PCR الوقت الحقيقي الكمية 2 أيام بعد حقن siRNA، تم تحقيق انخفاض في مستويات التعبير من 58٪ مما يشير إلى أن كفاءة التسليم والضربة القاضية كافية للوظيفية التحليلات22. بدائل لاختبار كفاءة الضربة القاضية هي إما تحليلات المناعة أو الفلورة المناعية مع الأجسام المضادة الموجهة ضد الجين المستهدف. وينبغي تحديد كفاءة وخصوصية الرنا المستخدمة في الحقن في الجسم الحي قبل الحقن في الفئران، على سبيل المثال، عن طريق اختبار الكفاءة في الخلايا الساتلية المعزولة أو الخصائص الأساسية. استخدام تجمع الذكية تتكون من 4 siRNAs مختلفة مقابل siRNA واحد يزيد من كفاءة الضربة القاضية ولكن أيضا يزيد من خطر استهداف غير محدد. وينبغي اختبار خصوصية جميع تسلسلات siRNA المستخدمة في ثقافة الخلايا لتجنب الآثار خارج الهدف. كتحكم, وينبغي استخدام siRNA سارعت غير المستهدفة منذ حقن siRNA في حد ذاته قد تؤثر على عملية التجديد بسبب الحقن، وبالتالي، ضرر إضافي للعضلة. النقطة الزمنية لحقن siRNA يعتمد على السؤال العلمي وعلى ملف التعبير عن الجين المستهدف. وبوجه عام، فإن حقن السيرنا ذاتية التسليم في اليوم الثالث بعد إصابة السموم القلبية يستهدف معظم الجينات الهامة لانتشار الخلايا الساتلية لأن انتشار الخلايا الساتلية يبلغ ذروته في اليوم الثالث بعد الإصابة. يجب ألا تقل النقطة الزمنية لحقن siRNA الأول عن 48 ساعة بعد إصابة توكسين القلب لأن حجم حقن توكسين القلب مرتفع جداً وينبغي أن تتم إعادة امتصاص السائل قبل حقن حلول إضافية في العضلات. بشكل عام, حقن متعددة من siRNAs أو مزيج من siRNAs مختلفة ممكن على الرغم من أن المرء يجب أن تنظر في أن كل حقن في العضلات المجددة يسبب ضررا إضافيا.
أحد قيود الطريقة الموصوفة هو حقيقة أن التأثير الذي لوحظ لا يعتمد بالضرورة على الضربة القاضية للجين المستهدف في الخلايا الساتلية فحسب، بل يمكن أن يعزى إلى أنواع خلايا أخرى مثل الخلايا المناعية أو خلايا السلف الليفية الأديبية. ولذلك، من الضروري الجمع بين تلك التجارب والتجارب التي تحقق في مجموعة نقية من الخلايا الساتلية. يمكن للمرء إما إجراء تجارب باستخدام الثقافات myofiber العائمة، حيث يتم زرع الخلايا الساتلية على myofibers المجاورة لها أو إجراء تجارب زرع باستخدام خلايا الأقمار الصناعية المعزولة17.
بديل لحقن siRNAs ذاتية التسليم هو حقن مثبطات جزيء صغير أو البروتينات المؤتلفة التي يمكن القيام بها، اعتمادا على السؤال العلمي. على سبيل المثال، تم بنجاح حقن فيبرونكتين بروتين مصفوفة خارج الخلية أو مثبطات جزيء صغير من إشارات JAK / STAT في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين15،16. ولا يمكن تحليل وظيفة جينية معينة في نوع معين من الخلايا أثناء تجديد العضلات الهيكلية، على سبيل المثال، في الخلايا الساتلية، إلا من خلال استخدام نموذج فأر وراثي لا يمكن التنفّس. حقن siRNAs ذاتية التسليم، والبروتينات المؤتلفة أو مثبطات جزيء صغير قد تؤثر على أنواع الخلايا متعددة في تجديد العضلات الهيكلية.
The authors have nothing to disclose.
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |