Wir beschreiben eine In-vivo-Methode zur Untersuchung des funktionellen Verlustes eines bestimmten Gens in Satellitenzellen mithilfe einer Kombination aus kardiotoxinvermittelter Verletzung des Skelettmuskels und der Injektion einer selbstliefernden siRNA.
Der Skelettmuskel besitzt eine enorme Fähigkeit, sich nach Verletzungen zu regenerieren. Dieser Prozess wird hauptsächlich von Muskelstammzellen angetrieben, die auch als Satellitenzellen bezeichnet werden. Satellitenzellen zeichnen sich durch die Expression des Transkriptionsfaktors Pax7 und ihre Position unterhalb der Basallamina im ruhenden Skelettmuskel aus. Bei Verletzungen werden Satellitenzellen aktiviert, durchlaufen selbstErneuerung oder Differenzierung, um entweder neue Myofiber zu bilden oder mit beschädigten zu verschmelzen. Die Funktionalität von Satellitenzellen in vivo kann mit einem kardiotoxinbasierten Verletzungsmodell des Skelettmuskels untersucht werden. Um die Funktion eines Gens während der Regeneration des Skelettmuskels zu untersuchen, werden meist transgene Mausmodelle verwendet. Hier stellen wir eine alternative Methode zu transgenen Mäusen vor, um die Genfunktion in Satellitenzellen während der Regeneration zu untersuchen, z. B. in Fällen, in denen transgene Mäuse nicht verfügbar sind. Wir kombinieren die kardiotoxinvermittelte Verletzung eines bestimmten Skelettmuskels mit der Injektion einer selbsttragenden siRNA in den regenerierenden Muskel, der dann von Satellitenzellen unter anderen Zellen aufgenommen wird. Dabei bieten wir eine Methode zur Analyse der Genfunktion in Satellitenzellen während der Regeneration unter physiologischen Bedingungen, ohne dass transgene Mäuse benötigt werden.
Skelettmuskel ist das größte Gewebe des Körpers, das etwa 40% des gesamten Körpergewichts ausmacht und eine freiwillige Fortbewegung ermöglicht. Die Gewebearchitektur des Skelettmuskels besteht hauptsächlich aus postmitotischen, endlos differenzierten, multinukleierten Myofikern sowie verschiedenen anderen Zellen aus dem peripheren Nervensystem, dem Gefäßsystem und den interstitiellen Zellen1. Wichtig ist, Skelettmuskel hat eine enorme Fähigkeit zu regenerieren und wieder funktionsfähig bei Verletzungen oder Schäden2. Dieser Prozess hängt von den Gewebe-Resident Muskelstammzellen auch als Satellitenzellen3,4. Satellitenzellen befinden sich zwischen dem Myofiber und der Basallamina und zeichnen sich durch die Expression des Transkriptionsfaktors Pax75,6,7aus. Unter atostatischen Bedingungen sind Satellitenzellen still, werden aber durch traumatische Verletzungen aktiviert, z.B. durch exzentrisches Training oder experimentell durch Injektion des Schlangengifteskardiotoxin6,8. Einmal aktiviert, koprimieren Pax7-positive Satellitenzellen MyoD und Myf5, was die Stammzellen zu einer myogenen Differenzierung verpflichtet. Satellitenzellen, die der Upregulation von Verpflichtungsfaktoren widerstehen, werden ihr Stammkraftpotenzial behalten und zur Ruhe zurückkehren, um den Stammzellpool für zukünftige Anforderungen aufzufüllen. Nach der Erweiterung des myogenen Vorläuferpools werden Transkriptionsnetzwerke durch Differenzierungsfaktoren wie Myogenin aktiviert, um den Zellzyklusausgang und die Terminaldifferenzierung zu initiieren. Diese Myoprogenitoren verschmelzen dann miteinander oder zu bestehenden Myofibiden, die Myonuclei beisteuern, um die Größe der myonuklearen Domäne zu erhalten. Die Myofibers drücken terminale Muskeldifferenzierungsgene wie Myosin Heavy Chain aus. Schließlich wachsen und reifen die neu gebildeten Myofiber, um die funktionellen Einheiten des Skelettmuskels9,10zu bauen.
Die Regeneration des Skelettmuskels kann durch verschiedene Erkrankungen wie Muskelerkrankungen oder Alterung11,12beeinflusst werden, von leichten Beeinträchtigungen bis hin zu lebensbedrohlichen Erkrankungen, z.B. bei Duchenne-Muskeldystrophie13 , 14. Daher zielt die regenerative Medizin darauf ab, beschädigtes oder fehlerhaftes Skelettmuskelgewebe mit seiner inhärenten regenerativen Kraft wiederherzustellen, indem die Satellitenzellfunktion15,16ins Visier genommen wird. Um sein volles Potenzial auszuschöpfen, ist ein umfassendes Verständnis der Satellitenzellen in ihrer endogenen Nische bei der Regeneration des Skelettmuskels erforderlich. Obwohl experimentelle Ansätze existieren, um Satellitenzellen neben ihren Myofibers zu isolieren17, kann die volle Komplexität der zellulären und systemischen Wechselwirkungen von Satellitenzellen mit ihrer Umgebung nur in vivo rekapituliert werden. In dieser Hinsicht wurde großes Wissen über die Regeneration der Skelettmuskulatur mit den Mausverletzungsmodellen2,18erworben.
Hier stellen wir ein spezifisches experimentelles Mausverletzungsmodell vor, um die stammzellenvermittelte Regeneration von kardiotoxininduzierten Schäden des tibialis vorderen Muskels in vivo zu untersuchen. Kardiotoxin, ein von einer Schlange abgeleitetes zytolytisches Toxin, das Myofiberdepolarisation und Nekrose verursacht, wird in den tibialis vorderen Muskel injiziert, was wiederum eine Gewebedegeneration mit anschließender Regeneration auslösen wird. Um die Funktion von Genen während der akuten Regeneration zu analysieren, werden selbstliefernde siRNAs am 3. Tag nach einer Verletzung, auf dem Höhepunkt der Satellitenzellexpansion, injiziert. Versuchstiere werden an verschiedenen Zeitpunkten geopfert und die tibialis vorderen Muskeln gesammelt. Die sezierten Muskeln werden eingefroren und für weitere Kryo-Sektionen verarbeitet. Die Immunfluoreszenzmikroskopie wird dann verwendet, um Marker der Regeneration zu analysieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Funktion eines einzelnen Gens während der satellitenzellgesteuerten Regeneration des Skelettmuskels mit Wildtypmäusen.
Hier stellen wir eine Methode vor, um die Funktion eines bestimmten Gens während der Regeneration des Skelettmuskels ohne transgene Tiere zu untersuchen. Dies wird durch die Kombination von Kardiotoxin induzierten Muskelverletzungen mit der Injektion einer selbsttragenden siRNA in den regenerierenden Skelettmuskel an Tag 3 nach Verletzungen erreicht. Wir haben detailliert die Verfahren der Muskelverletzung durch Kardiotoxin, die Injektion der selbstliefernden siRNA und die Verarbeitung der geernteten Muskeln beschrieben, um den Fortschritt der Regeneration zu analysieren. Wir zeigen, dass die Injektion des Schlangengiftkardiotoxins in den Skelettmuskel effektiv den gesamten Muskel verletzt und dass selbsttragende siRNAs in rund 75% aller Satellitenzellen unter anderen Zelltypen zwei Tage nach ihrer Injektion in die regenerierenden Skelettmuskel (Abbildung 4, Abbildung 5).
Besonderes Augenmerk sollte auf eine homogene Verletzung des tibialis vorderen Muskels gerichtet werden, da unterschiedliche Verletzungsgrade das Regenerationsergebnis beeinflussen und dadurch auch die Wirkung der siRNA beeinflusst werden könnte. Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, dass der gesamte regenerierende Bereich mit der selbstliefernden siRNA injiziert wird. Für die Analyse des Regenerationsprozesses wird empfohlen, immer ähnliche Bereiche des regenerierenden Skelettmuskels zu vergleichen, daher sollte der tibialis vordere Muskel halbiert werden, um immer den mittleren Bauchbereich des Muskels zu vergleichen. Bei der Analyse des Muskels muss die gesamte Kryosektion analysiert werden, da sich die Myofiberzusammensetzung im tibialis vorderen Muskel unterscheidet und sich daher anders regenerieren könnte.
Die Funktion von Satellitenzellen kann durch verschiedene experimentelle Verfahren einschließlich ihrer Kultur auf den angrenzenden isolierten einzelmyofibers17untersucht werden, durch Transplantation und durch Dieanalyse der Regeneration des Skelettmuskels nach induzierten Verletzungen 18,19. Die Untersuchung der Funktion von Satellitenzellen mithilfe eines in vivo induzierten Verletzungsmodells, z. B. der Injektion von Kardiotoxin, bietet die Möglichkeit, die Satellitenzellfunktion auch in Bezug auf ihre Interaktion mit anderen Zelltypen wie Makrophagen und Untersuchung des Einflusses systemischer Faktoren2. Verletzungen des Skelettmuskels können auf verschiedene Weise erreicht werden, z.B. exzentrische Übung, Gefrierverletzung, Injektion von BaCl2 oder Injektion von Schlangengiften wie Kardiotoxin oder Notexin18. Während exzentrische Bewegung ist wahrscheinlich die physiologische Verletzung saniert, ist die Verletzung eines bestimmten Muskels nur begrenzt20. Frostverletzungen können angewendet werden, wenn die Migration von Satellitenzellen zum Ort der Verletzung das Ziel der Studie ist oder nur ein bestimmter Teil des Muskels verletzt werden sollte. Experimentell ist der Nachteil von Frostverletzungen die offene Operation, die durchgeführt werden muss, um die vorgekühlte Metallsonde anzuwenden. Die Injektion von BaCl2 oder Schlangengifte ist die dramatischste Verletzungsmethode, wodurch die Satellitenzellfunktion am meisten in Frage kommt. Darüber hinaus ist die Injektion minimal-invasiv, die Operationszeit beträgt im Allgemeinen weniger als fünf Minuten und beinhaltet keine Naht usw. und minimiert so das Infektionsrisiko.
Muskelverletzungen werden hauptsächlich verwendet, um die funktionellen Folgen des Verlusts von Genfunktionen zu untersuchen, z.B. Verlust von Pax77,21. Gerade wenn gealterte Mäuse im Fokus der wissenschaftlichen Frage stehen, ist die Erzeugung oder Verwendung transgener Mäuse oft nicht machbar. Die Injektion von selbstliefernden siRNAs, die auf ein bestimmtes Gen abzielen, ist in diesen Fällen eine praktikable Alternative und wurde erfolgreicheingesetzt 22. Kurz gesagt, der tibialis vordere Muskel von Mäusen wurde durch Injektion von Kardiotoxin verletzt und selbstliefernde SiRNAs gegen Fibronectin (FN) wurden am 3. Tag nach einer Verletzung injiziert. Die Muskeln wurden 10 Tage nach der Verletzung analysiert und eine signifikante Abnahme der Satellitenzellzahlen wurde bei siFN im Vergleich zu verwirrten siRNA-Kontrollbedingungen beobachtet. Die Knockdown-Effizienz wurde in ganzen Muskellysaten durch quantitative Real Time PCR 2 Tage nach siRNA-Injektion bestimmt, eine Verringerung der Expressionsniveaus von 58% wurde erreicht, was darauf hindeutet, dass die Liefer- und K.o.-Effizienz für die funktionelle analysiert22. Alternativen zum Testen der Knockdown-Effizienz sind entweder Immunoblot- oder Immunfluoreszenzanalysen mit Antikörpern, die gegen das Zielgen gerichtet sind. Die Effizienz und Spezifität der siRNA, die für In-vivo-Injektionen verwendet wird, sollte vor der Injektion in Mäuse bestimmt werden, z. B. durch Die Prüfung der Effizienz in isolierten Satellitenzellen oder primären Myoblasten. Die Verwendung eines intelligenten Pools, der aus 4 verschiedenen siRNAs im Vergleich zu einer einzelnen siRNA besteht, erhöht die Effizienz von Knockdown, erhöht aber auch das Risiko unspezifischer Targeting. Die Spezifität aller verwendeten siRNA-Sequenzen sollte in der Zellkultur getestet werden, um Off-Target-Effekte zu vermeiden. Als Kontrolle sollte eine nicht zielgerichtete Scrambled siRNA verwendet werden, da die Injektion einer siRNA per se den Regenerationsprozess durch die Injektion und damit zusätzliche Schäden des Muskels beeinflussen könnte. Der Zeitpunkt der Injektion der siRNA hängt von der wissenschaftlichen Frage und dem Expressionsprofil des Zielgens ab. Im Allgemeinen zielt eine Injektion von selbstliefernder siRNA an Tag 3 nach einer Kardiotoxinverletzung auf die meisten Gene ab, die für die Proliferation von Satellitenzellen wichtig sind, da die Proliferation von Satellitenzellen um Tag 3 nach einer Verletzung ihren Höhepunkt erreicht. Der Zeitpunkt für die erste siRNA-Injektion sollte nach einer Kardiotoxinverletzung nicht weniger als 48 h betragen, da das Injektionsvolumen von Kardiotoxin recht hoch ist und die Resorption der Flüssigkeit vor der Injektion zusätzlicher Lösungen in den Muskel hätte erfolgen müssen. Im Allgemeinen sind mehrfache Injektionen von siRNAs oder eine Kombination verschiedener siRNAs möglich, obwohl man berücksichtigen muss, dass jede Injektion in den regenerierenden Muskel zusätzliche Schäden verursacht.
Eine Einschränkung der beschriebenen Methode ist die Tatsache, dass der beobachtete Effekt nicht unbedingt nur vom Knockdown des Zielgens in Satellitenzellen abhängt, sondern auch anderen Zelltypen wie Immunzellen oder fibro-adipogenen Vorläuferzellen zugeschrieben werden könnte. Daher ist es notwendig, diese Experimente mit Experimenten zu kombinieren, die eine reine Population von Satellitenzellen untersuchen. Man kann entweder Experimente mit schwimmenden Myofiberkulturen durchführen, bei denen Satellitenzellen auf ihren angrenzenden Myofibern kultiviert werden, oder Transplantationsexperimente mit isolierten Satellitenzellen durchführen17.
Eine Alternative zur Injektion von selbstliefernden siRNAs ist die Injektion von kleinen Molekülinhibitoren oder rekombinanten Proteinen, die je nach wissenschaftlicher Frage durchgeführt werden können. Zum Beispiel wurde die Injektion des extrazellulären Matrixproteins Fibronectin oder kleiner Molekülinhibitoren der JAK/STAT-Signalisierung bei gealterten Mäusen15,16erfolgreich durchgeführt. Die Analyse einer bestimmten Genfunktion in einem bestimmten Zelltyp während der Regeneration des Skelettmuskels, z.B. in Satellitenzellen, ist nur durch den Einsatz eines induzierbaren genetischen Mausmodells möglich. Injektionen von selbst liefernden siRNAs, rekombinanten Proteinen oder kleinen Molekülinhibitoren könnten mehrere Zelltypen bei regenerierenden Skelettmuskeln beeinflussen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |